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一般染色および特殊染色の手引き

James Anderson , Global Marketing Manager
Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

通常のHE染色と特殊染色は、組織ベースの診断や研究で重要な役割を果たします。透明な組織切片を着色することにより、高度に訓練された病理医や研究者は、これらの染色により、顕微鏡で組織の形態(構造)を観察したり、特定の細胞タイプ、構造、または細菌などの微生物に関しても、それらの存在やその頻度を探索することができます。

組織病理学研究室では、「一般染色」とは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色(HE)を指します。この染色法は、すべての組織標本で、根底にある組織の構造と状態を明らかにするために「日常的に」使用されます。「特殊染色」は、病理医や研究者が必要とするすべての情報をHEでは入手できない場合に使用される、多数の代替染色技術を指すために長い間使用されてきた用語になります。

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染色のための組織の調製

組織を染色して観察する前に、組織を調製し、非常に薄い切片、すなわち1細胞の厚さに薄切して顕微鏡のスライドにのせられるようにする必要があります。組織を固定し(腐敗しないように)、次に硬化させて保持し、必要とされる非常に薄い切片(通常2〜7 µm)に薄切できるようにします。このために使用される2つの主な手法があり、凍結切片とパラフィン包埋切片と呼ばれています。

凍結切片 は、通常、外科医が腫瘍を切除する際、手術中に切除マージンを知る必要があり、早く回答が必要な場合に使用されます。凍結切片は、すぐに作成できますが、通常、パラフィン技術と同等の切片品質にはなりません。凍結切片作製のプロセスは次のとおりです:

  1. 組織を急速に凍結し、保存および硬化します。
  2. 凍結組織をクリオスタット (凍結チャンバー内のセクショニングミクロトーム) 内で切片にし、染色のために顕微鏡のスライドにのせます。
  3. 切片を、形態が崩れ始める前に、直ちに固定し、その後染色します。

パラフィン切片を準備する場合は、標本をまず固定液で保存し、次にパラフィンを標本に浸透させることにより組織構造をサポートします。このプロセスは、凍結切片を作成するよりも時間がかかりますが、ほとんどの場合、染色の品質はより良く、結果として得られるサンプル(ブロックと呼ばれます)はほぼ無期限に保存できます。パラフィン切片作製のプロセスは次のとおりです:

  1. 固定 により組織を保護する(通常 ホルムアルデヒド・ベースの溶液)。
  2. 切り出し で切片にする組織の特定の領域を単離する。
  3. 組織処理 では、一連の試薬を使用して、水性(水ベース)環境を疎水環境に置き換えます。これにより組織成分にパラフィンが浸透できるようになります。
  4. 包埋 により標本の向きが決まり、切片薄切と保存のために標本をパラフィンのブロック内に包埋します。
  5. 切片作製は ミクロトーム 上で行い、非常に薄い切片を薄切し、ウォーターバスで浮かせて取り出し、顕微鏡のスライドに載せます。
  6. 次に、スライドをオーブンまたはホットプレートで乾燥させて水分を除き、組織をスライドに付着させます。
  7. スライド上の組織はこの時点で染色が可能です。
  8. 最初の染色ステップは脱パラフィンで、染色前に溶媒を使用してスライドからパラフィンを除去します。これは常に染色プロセスの一部として行われます。染色が完了すると、切片をカバーガラスで覆います。これで、標本が永久的なものになります。
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A microtomist creating a “ribbon” of very thin sections for staining
図1:染色用の非常に薄い切片の「リボン」を作製するミクロトミスト

HE染色が日常的に使われるのはなぜか

 

ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色は組織病理学研究室で日常的に使用されています。その理由は、病理医/研究者に非常に詳細な組織像を提供するからです。細胞質、核、小器官、細胞外成分などの細胞構造を明瞭に染色することによりこれが達成されます。この情報は、多くの場合、細胞の組織化(または組織崩壊)に起因する疾患の診断を可能にするのに十分であり、実際の細胞の異常や特定の指標(癌で典型的に見られる核変化など)も示します。IHC/ISH染色を使用する場合でも、HE染色は診断画像の重要な部分を形成しています。というのは、HE染色により根底にある組織の形態が分かるので、病理医/研究者がIHC/ISH染色を正しく解釈することができるからです。

臨床組織学検査室では、すべての標本は最初にHEで染色され、特殊染色またはIHC/ISH染色は、より詳細な分析のために追加の情報が必要な場合にのみ指示されます。たとえば、2つの形態学的に類似した癌のタイプを区別する場合などです。

必要とされるHE染色の量が多いので、ほとんどの臨床検査室では完全自動化システムを使用しており、手作業による染色は現在ほとんど行われていません。

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This section from the mucosa of small intestine shows well-defined heterochromatin and nucleoli in epithelial cells and plasma cells within the lamina propria
図2:この小腸粘膜の切片は、 粘膜固有層の上皮細胞および形質細胞内にあるヘテロクロマチンおよび核小体をはっきり示しています
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Mitotic figures are sharply stained within the glandular epithelium in a section of small intestine
図3:小腸の切片において、有糸分裂像が腺上皮内ではっきりと染色されています
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In this field from the lamina propria of small intestine, the cytoplasm of plasma cells has stained with hematoxylin except for the pale peri-nuclear area, which corresponds with a well-developed Golgi apparatus
図4:この視野は、小腸の粘膜固有層ですが、よく発達したゴルジ装置に対応する淡い核周辺部を除いて、形質細胞の細胞質がヘマトキシリンで染色されています
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This autonomic ganglion from the myenteric plexus, located between the smooth muscle layers of the muscularis externa of the small intestine, contains ganglionic nurones that show well-defined basophilic Nissl substance (aggregations of endoplasmic reticu
図5:この自律神経節は、小腸の外筋層の平滑筋層の間にある筋層間神経叢由来で、細胞質中に明確な好塩基性ニッスル物質(小胞体とリボソームRNAの凝集体)を示す、神経節ニューロンを含んでいます

HEの化学

HE染色は2つの色素、ヘマトキシリンとエオジンを使用します。これらの色素は異なる組織成分を染色するので、この組み合わせが使用されます。

ヘマトキシリンは、 塩基性 色素のように反応し、紫がかった青色です。酸性または好塩基性の構造、例えば、細胞核(DNAと核タンパク質など)や、RNAを含む細胞小器官であるリボソームや粗面小胞体などを染色します。

エオジンは 酸性 色素で、通常は赤みがかったピンク色です。塩基性または好酸性の構造、例えば、細胞質、細胞壁、細胞外繊維などを染色します。

色素の起源

ヘマトキシリンは、ログウッドの木から抽出され、精製されます。次に、酸化させ、媒染剤(通常はアルミニウム)と結合させて、細胞構造に結合できるようにします。組織学的検査で使用されている多くのヘマトキシリン製品のうち、ギルのヘマトキシリン、ハリスのヘマトキシリン、マイヤーのヘマトキシリンが最もよく使用されます。

エオジンは、臭素と蛍光色素との反応によって形成されます。組織学的検査では一般的に2種類のエオシンが使用されます。わずかに黄色がかったエオジンYとわずかに青みがかったエオジンBです。エオジンYが最もよく使用されます。

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Hematoxylin chemical structure
図6:ヘマトキシリンの化学構造
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Eosin Y chemical structure
図7:エオジンの化学構造

特殊染色液

特殊染色という用語は、伝統的にはHE以外の染色を指していました。さまざまな方法が含まれていて、HE染色では同定されない、特定の組織構造、成分や微生物を可視化するために使用されます。

他の染色法としては、特定のタンパク質やDNA/RNA配列を標的とした 免疫組織化学的検査 やin-situハイブリダイゼーションが用いられます。これらの方法を「特殊染色」ファミリーのメンバーに含めることもありました。しかし、方法や目的がまったく異なるので、現在では、「IHC/ISH染色」と呼ばれる、3番目のカテゴリに分類されるのが普通です。

あらゆる目的のために文字通り何百種類もの特殊染色がありますが、臨床組織学的検査で常に使用されているものは少ししかありません。この染色の多様性のため、特殊染色はHE染色ほど自動化されていません。多くの大規模な検査室は自動免疫染色装置 を一般的な染色に使用しますが、まだ手で染色する領域も残っています。一部の染色の複雑さも、自動免疫染色装置使用の妨げになっています。

よく使用されるいくつかの特殊染色

以下の画像は、いくつかの一般的な特殊染色とその用途を示しています。

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The Masson’s Trichrome Stain Kit is intended for use in histological observation of collagenous connective tissue fibers in tissue specimens. It is used to assist in differentiating collagen and smooth muscle in tumors and assists in the detection of di
図8:マッソンのトリクローム(皮膚)。この染色は、組織標本中のコラーゲン性結合組織繊維の組織学的観察で使用されます。この染色の使用は、腫瘍におけるコラーゲンと平滑筋の識別に役立つと共に、疾患や結合組織/筋肉組織の変化の検出に役立ちます。
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The Modified GMS Silver Stain Kit is intended for use in histological observation of fungi, basement membrane and some opportunistic organisms such as pneumocystis carinii in tissue specimens.
図9:改変GMS銀染色(左:ニューモシスティス、肺)(右:アスペルギルス感染、肺)。改良型GMSシルバー染色キットは、菌類、基底膜、および組織標本内のニューモシスチスカリニなどの一部の日和見菌の組織学的観察で使用されます。
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Periodic Acid Schiff (PAS) staining is mainly used for staining structures containing a high proportion of carbohydrates such as glycogen,glycoproteins, proteoglycans typically found in connective tissues, mucus and basement membranes. Often used to stain
図10:過ヨウ素酸シッフ染色(腎臓)。 PAS 染色は、グリコーゲン、糖タンパク質、結合組織内で一般的に見られるプロテオグリカン、粘液、および基底膜など、高比率の炭水化物を含む構造の染色に主に使用されます。腎生検試料、肝生検試料、横紋筋内の特定の糖原病、および真菌感染症の疑いの染色によく使用されます。
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Perls’ Prussian Blue Iron stains are used to detect and identify ferric (Fe3+) iron in tissue preparations, blood smears,or bone marrow smears. Minute amounts of ferric acid are commonly found in bone marrow and in the spleen. Abnormal amounts of iron c
図11:Perlのプルシアンブルーアイロン(肝臓)。この染色は、組織標本、血液塗抹標本、または骨髄の塗抹標本内の鉄(Fe3+)イオンの検出および特定に使用します。微量の鉄イオン(ヘモシデリン)が、骨髄内および脾臓内に通常見られます。異常な量の鉄は、ヘモクロマトーシスおよびヘモジデローシスを示すことがあります。
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Acid Fast Bacillus stains are used to detect and identify acid fast bacilli in tissue. Bacilli are rod-shaped bacterial organisms. A primary function of this stain is to identify tuberculosis in lung tissue, as well as other bacterial bacillus infected ti
図12:チール・ネールゼン染色(抗酸菌、肺)。この染色は、組織内の抗酸菌の検出および特定に使用します。桿菌は棒状の細菌です。この染色の主な機能は、肺組織内の結核を特定することです。
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Alcian Blue is normally prepared at an acidic pH of 2.5 and is used to identify acid mucopolysaccharides and acetic mucins. Excessive amounts of non-sulfated acidic mucosubstances are seen in mesotheliomas, certain amounts occur normally in blood vessel w
図13:アルシアンブルー(小腸)。アルシアンブルーは、通常2.5の酸性pHで調整され、酸性ムコ多糖類および酸性ムチンを特定するために使用します。過剰な量の非硫酸酸性ムコ多糖類が、中皮腫内で見られます。ある程度の量は、血管壁で普通に生じますが、アテローム性動脈硬化の初期の病変内で増加します。
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Alcian Blue and PAS combines the properties of both Alcian Blue and Periodic Acid Schiff staining.
図14:アルシアンブルーと PAS(小腸)。アルシアンブルーと過ヨウ素酸シッフ染色の両方の特性を組み合わせた染色。
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Gomori Trichrome (blue) (submucosa). Trichrome stains are used to stain and identify muscle fibers, collagen and nuclei. They can be used to contrast skeletal, cardiac or smooth muscle. The Gomori Trichrome is a simplification of the more elaborate Masson trichrome stain and combines the plasma stain (chromotrope 2R) and connective tissue stain to provide a brilliant contrasting picture.
図15:ゴモリ・トリクローム(ブルー)(粘膜下層)。トリクローム染色は、筋繊維、コラーゲン、および細胞核の染色ならびに特定に使用します。骨格筋、心筋、または平滑筋の対比染色にも使用可能です。ゴモリ・トリクロームは、より複雑なマッソントリクローム染色を簡易化したもので、血漿染色(クロモトロープ2R)と結合組織染色を合わせて、鮮明な対比を示す画像を提供します。
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Gomori Trichrome (green) (submucosa). Trichrome stains are used to stain and identify muscle fibers, collagen and nuclei. They can be used to contrast skeletal ,cardiac or smooth muscle. The Gomori Trichrome is a simplification of the more elaborate Masson stain and combines the plasma stain (chromotrope 2R) with the connective tissue stain to provide a brilliant contrasting picture.
図16:ゴモリ・トリクローム(グリーン)(粘膜下層)。トリクローム染色は、筋繊維、コラーゲン、および細胞核の染色ならびに特定に使用します。骨格筋、心筋、または平滑筋の対比染色にも使用可能です。ゴモリ・トリクロームは、より複雑なマッソントリクローム染色を簡易化したもので、血漿染色(クロモトロープ2R)と結合組織染色を合わせて、鮮明な対比を示す画像を提供します。

よりよい特殊染色へのステップ

ライカバイオシステムズのビジョンは、がん診断を進歩させ、生活を改善することです。このビジョンを実現する1つの方法は、染色品質の向上を支援することです。 IHC と ISH の品質は染色試薬から生じるものではないと認識しているため、このシリーズでは染色品質のさまざまな側面を検討し、将来の検査が診断の改善にどのように影響するかを検討します。

ステップ64 - 染色を理解する

その染色をすることで何を示そうとしているのかを理解してください。

ただ「方法に従う」だけで、完成した切片中に何が見えなければならないかが明確に分かっていないと、悪い結果につながります。

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Understand the Stain
A:PASで染色された肝臓の切片。リポフスチンとグリコーゲンは PAS 陽性であり、微量の胆汁とヘモシデリンは PAS 陰性であり、自然な色で表示されます(それぞれ黄色と茶色)。 B:この切片は、グロコット-ゴモリ法で染色された肺内の日和見真菌感染症(アスペルギルス)を示しています。真菌の菌糸は、染色されていない炭素と同様に黒色で、喫煙者や大部分の都市居住者の肺に共通の特徴です。

ステップ65 – ポジティブコントロールの使用

示そうとしている構造/物質を含むことがわかっているコントロールスライドを常に使用してください。

「染色しようとした構造/物質がスライド中に見えない場合は、存在していないと考えます。」

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Use a Positive Control
鉄を含むヘモジデリンを示すパールの方法で染色された肝硬変の切片(ブルー)。これは、鉄の染色に対するコントロールブロックとしての条件を満たします。

ステップ66 - 正確な時間で行う

ステップ66 - 正確な時間で行ってください。

時間が常におおよその場合。時間が不正確だと、一貫性のない結果になります。

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Use Accurate Timing
同じブロック由来のこれら皮膚の切片はいずれも PAS 法で染色されています。切片Aは過ヨウ素酸(酸化ステップ)で5分間処理されましたが、切片Bでは30秒しか処理されていません(過失)。その結果、切片Bでは基底膜の染色が極めて不十分であることに注意してください。

ステップ67 - 試薬の安定性を考慮する

使用している試薬の 保存期間 に注意してください。一部の試薬や色素溶液は劣化するのに時間がかかりますが、他の試薬や色素溶液は非常に不安定であり、用時調整してすぐに使用する必要があります。使用前にと酸化(熟化)させるために、しばらく放置する必要がある試薬もあります。

私たちは すべての試薬は無期限に使用できると想定しています。

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Consider Reagent Stability
過酸化によるMuddy Weigertのヘマトキシリン。コラーゲンが茶色に染色されていることに注意してください。

ステップ68 - 試薬を正しく保管する

試薬を正しく保管してください。試薬の中には真菌やカビの成長を促す傾向があるものもありますので、その場合は冷蔵保存が必要になります。光に敏感なものは、暗所での保管が必要です。

「試薬はすべて染色ベンチの上の棚に保管しています。時折、切片に浮遊生物が見られることがあります。」

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Store Reagents Correctly
この切片には、外来微生物の大きな沈着物が見えます。これは、染色液(この場合はヘマトキシリン)中で成長し、その後切片上に沈着したものです。

ステップ69 - 方法を着実に実行する

プロトコルに正確に従ってください。

同じプロトコルを使用していると思われるのに、スタッフメンバーにより結果が異なります。

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Adhere to the Method
これらのホルマリン固定された粘膜下組織の切片は、マッソントリクローム染色で染色されています。切片Aは赤い平滑筋を示しています。この例では、染色は検査室のプロトコルに従って正しく行われ、準備段階のクロム酸ステップ(感作または二次媒染)も実施されました。このステップは、切片Bを染色した時には見落とされていました。切片B(小腸)では筋肉の色に差がないことに注意してください。

ステップ70 - 変更をすべて記録する

使用している方法から逸脱した際にはすべてを記録してください。

結果がよくない場合に、プロトコルの変更が記録されていないと、原因を解明することが困難または不可能な場合があります。

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Record Any Changes
このレチクリンの鍍銀染色では、繊維がはっきり見えず、スライドの背景にスカム(沈殿物)があります。方法に厳密に従っていなかった場合、このような問題の原因を特定することは非常に困難です(Gordon&Sweets法、腎臓)。

ステップ71 - 洗浄ステップを標準化する

洗浄手順には特に注意してください。結果の変動原因となることが多いので、できるだけ標準化してください。

研究室のスタッフはさまざまな洗浄技術を使用しています。激しく攪拌をする人もいれば、軽く攪拌する人もいます。

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Standardize Washing Steps
これらの肝臓切片は同じ方法で染色されています。唯一の違いは、含浸と還元の間に使用された洗浄技術です。レチクリン繊維は黒色ですが、切片Aのほうがより明確に示されています(Gordon&Sweets法)。

ステップ72 - 顕微鏡を慎重にセットアップする

分化段階などの重要な段階では顕微鏡制御を使用してください。カバーグラスのない(ウェット)切片の見え方に及ぼす顕微鏡セットアップの影響に注意してください。偽のバックグラウンド染色が見えてしまう場合があります。

すべての方法に関して、染色レベルを肉眼でスライドを見ることにより評価します。

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Set Up Microscope Carefully
A:コンデンサー絞りを閉じた顕微鏡で見たウェット切片(カバーグラスなし)。偽のバックグラウンドに注意してください。 B:コンデンサー絞りを開いた顕微鏡で見たウェット切片(カバーグラスなし)。きれいなバックグラウンドに注意してください。

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About the presenters

James Anderson, Global Marketing Manager

James Anderson is a Global Marketing Manager at Leica Biosystems with experience with histology and scientific, technical, and marketing communications.

Geoffrey Rolls, BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.