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標本処理の手引き

パラフィン切片のための組織処理ステップの概要

Microscopic analysis of cells and tissues requires the preparation of very thin, high-quality sections (slices) mounted on glass slides and appropriately stained to demonstrate normal and abnormal structures.

Most fresh tissue is very delicate and easily distorted and damaged, and it is thus impossible to prepare thin sections from it unless it is chemically preserved or “fixed” and supported in some way whilst it is being cut. Broadly, there are two strategies that can be employed to provide this support:

  1. 組織を凍結し、凍結したまま切片を薄切することができます。これらの切片は 「凍結切片」と呼ばれます。
  2. 適切な物理的性質を有する固体に変換することができる液剤を、組織標本に浸透させ、これにより薄切することができるようになります。パラフィンワックスはそのような薬剤の内の一つです。このようにして「パラフィン切片」が作成されます。

この記事では、切片の作製に用いることができるパラフィン包埋標本を作製するための組織処理方法について説明します。

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はじめに

組織処理」とは、動物やヒトの組織を、固定から、適切な組織学的検査用ワックスで完全に浸潤し、包埋してミクロトームで切片作製をする準備ができている状態にするまでに必要な手順のことです。

組織処理は手作業で行うことができますが(手処理)、複数の標本を処理する必要がある場合は、自動組織処理機(「ティッシュプロセッサー」)を使用するほうが便利ではるかに効率的です。これらのデバイスは1940年代から利用可能でしたが、1 徐々に進化しており、使用の安全性が向上し、多数の検体をより迅速に処理し、より良い品質の結果を生み出すようになっています。プロセッサーには主に2つのタイプがあります。1 つは、標本を容器から別の容器に移して処理する組織移送タイプ(または「ディップアンドダンク」)、もう1つは液体移送(または「密閉」)タイプで、標本が単一のプロセスチャンバーまたはレトルトに保持され、液体が必要に応じてポンプで出し入れされます。最新の液体移動処理装置の多くは、効果的な高温の液体循環方式を採用し、真空/圧力サイクルを組み込むことによって、処理手順を向上させ、処理時間を短縮しています。

最新の密閉型ティッシュプロセッサー

最新の密閉型ティッシュプロセッサー
「ディップアンドダンク」プロセッサーは、小さな検査室では依然として優れたオプションです。
Patients rely on quality tissue processing
Image of doctor and patient illustrating how patients rely on quality tissue processing

The importance of tissue processing

Most laboratory supervisors would emphasize to their staff the importance of tissue processing. It is worthwhile to stress that the use of an inappropriate processing schedule or the making of a fundamental mistake (perhaps in replenishing or sequencing of processing reagents) can result in the production of tissue specimens that cannot be sectioned and therefore will not provide any useful microscopic information. This can be disastrous if you are dealing with human diagnostic tissue where the whole of the specimen has been processed (“all in”). There is no spare tissue. There is no diagnosis. There is, however, a patient to whom an explanation has to be provided.

Although mechanical or electrical faults occasionally occur in tissue processors, processing mishaps where tissues are actually compromised mainly occur because of human error. It is important to emphasize the value of proper education and training for those carrying out tissue processing and the need to apply particular care when setting up a processor for any processing run.

パラフィン切片のための組織処理ステップの概要

1. 新鮮な標本の入手

新鮮な組織標本のソースはさまざまです。新鮮な組織標本は、患者や実験動物から摘出中に極めて容易に損傷を受ける可能性があることに注意しなければなりません。摘出後は、注意深く取り扱い、できるだけ早く適切に固定することが重要です。理想的には、固定は取り出した場所(恐らく手術室)で、またはこれが不可能な場合は検査室へ輸送した直後に行う必要があります。

2. 固定

標本を、 ホルムアルデヒド溶液(ホルマリン)などの液体固定剤(固定液)に入れます。固定液はゆっくりと組織に浸透し、化学的および物理的変化を引き起こし、組織を硬化・保持し、その後の処理ステップから保護します。2 固定 に使用できる試薬の数は限られています。というのは、この目的に適した特定の性質を備えている必要があるためです。たとえば、組織成分は、後で特定の染色技術を適用できるように、化学反応性を保持する必要があります。3ホルマリンは、通常リン酸緩衝液として、パラフィン切片作製用に処理される組織を保存するために用いられる最も一般的な固定液です。理想的には、標本は固定液が組織のすべての部分に浸透するのに十分な時間(固定の化学反応が平衡に達するための追加の時間(固定時間))、固定液中に留まる必要があります。これは、通常、標本を6~24時間固定する必要があることを意味します。ほとんどの検査室では、固定ステップをプロセッサーの最初のステーションとして使用します。

固定後、標本は検査のための適切な領域を選択するために、さらに切り出しが必要になる場合があります。処理される標本は、適切なラベル付きカセット(小さな穴あきバスケット)に入れられ、他の標本から隔離されます。標本処理に使用する処理スケジュールの時間は、標本のタイプと標本寸法の最大値と最小値、使用するプロセッサー、選択した溶媒、溶媒温度およびその他の要因によって異なります。次の例は、ライカの高速ティッシュプロセッサーPELORISでの使用に適した6時間のスケジュールに基づいています。

3. 脱水

溶融パラフィンワックスは、疎水性(水と混ぜることができない)のため、ワックスに浸透させる前に標本内の大部分の水を除去する必要があります。このプロセスは通常、標本を一連のエタノール(アルコール)溶液に浸し、水を含まない純粋なアルコールに到達するまで濃度を増加させることによって行われます。エタノールと水とはどのような比率でも混和するため、試料中の水は徐々にアルコールに置き換わります。アルコールの濃度を連続して上げていくことで、組織が極端に歪むことを防止しています。

厚さが4 mm以下の標本の典型的な脱水の順序は次のとおりです:

  1. 70%エタノール       15分
  2. 90%エタノール       15分
  3. 100%エタノール     15分
  4. 100%エタノール     15分
  5. 100%エタノール     30分
  6. 100%エタノール     45分

この時点で、わずかに残った強く結合した(分子)水を除いて、すべての水が標本から取り除かれているはずです。

4. 透徹

組織はこの時点で基本的に水を含んでいませんが、パラフィンとエタノールはほとんど混和しないのでパラフィンを浸透させることはまだできません。したがって、エタノールとパラフィンのいずれとも完全に混和できる中間溶媒を使用する必要があります。このような溶媒は、組織内のエタノールに置き換わり、次に溶融パラフィンワックスに置き換えられます。この処理段階は「透徹」と呼ばれ、使用される試薬は「透徹剤」と呼ばれます。「透徹」という用語が選ばれたのは、多くの透徹剤(すべてではありませんが)が比較的高い屈折率のをもつために組織に光学的透明性を与えるからです。透徹剤のもう1つの重要な役割は、ワックス浸透の障害となる脂質の大半を組織から除去することです。

一般的な透徹剤はキシレンであり、エタノールを完全に置換するには複数回の交換が必要です。

厚さが4 mm以下の標本の典型的な透徹の順序は次のとおりです:

  1. キシレン 20分
  2. キシレン 20分
  3. キシレン 45分

5. パラフィン浸透

この時点で、適切な組織学的検査用パラフィンを組織に浸透させることができます。長年にわたり多くの異なる試薬がこの目的で評価・使用されてきましたが、パラフィンワックスベースの組織学的検査用パラフィンが最も一般的です。典型的なパラフィンは60°Cで液体であり、この温度で組織に浸透できます。その後、20°Cまで冷却すると固化し、切片を着実に薄切できる固さになります。これらのワックスは、精製パラフィンワックスとスチレンやポリエチレンなどの樹脂を含むさまざまな添加剤との混合物です。これらのパラフィン製剤が、非常に特別な物理的特性を備えていることは評価されるべきでしょう。この特性により、パラフィンが浸透した組織は、少なくとも2 µmまでの厚さで切片にすることができ、回転式ミクロトームで切片が薄切されるときにはリボンを形成し、温水バスに浮かせた際に、十分な弾性を維持して完全に平らになるのです。

厚さが4 mm以下の標本の典型的な浸透の順序は次のとおりです:

  1. パラフィン 30分
  2. パラフィン 30分
  3. パラフィン 45分

6. 包埋

標本にパラフィンが完全に浸透したので、切片を薄切するために、ミクロトームに固定できる「ブロック」に成形する必要があります。このステップは、 「包埋センター」 を使用して実行されます。そこでは、モールドに溶融ワックスが充填され、その中に標本が配置されます。標本の向きをモールド内で非常に注意深く調整します。その理由は、標本の配置によって「切片の面」が決定されるためです。切片の面は、診断と研究、いずれの組織学的検査においても熟慮すべき重要事項です。カセットをモールドの上に置き、ワックスを追加した後、冷却されたプレート上に置いて固めます。その後、カセットが取り付けられたブロックをモールドから取り外し、 ミクロトームへの準備が整います。組織処理が適切に行われている場合、組織標本を含むワックスブロックは非常に安定しており、記録資料の重要なソースであることにご留意ください。

ティッシュプロセッサーへの標本のローディング
包埋

「キシレンフリー」の処理

キシレンは組織処理用の透徹剤として広く使用されていますが、毒性のある試薬であり、一部のラボではイソプロパノールや他のキシレン代替品など、毒性の低い代替品を使用することを好みます。この方法を成功させるには、浸透中にイソプロパノールを標本から除去できるように、より高いパラフィン温度が必要です。

標本に対する組織処理の影響

高品質の組織処理は正確な診断に不可欠です

固定と処理を組み合わせた効果は組織を硬化させることですが、収縮が生じることは避けられません。ワックスが浸透するまでに、組織は20%以上収縮すると推定されています4このような影響はありますが、最適に処理され、組織から 作製された切片 は、一貫して優れた形態学的詳細を示し、標本間で比較を行うことができ、正確な組織病理学的診断を行うことができます。

理論上も実際上も、薄切が最も容易なパラフィンブロックとは、柔らかく固さが比較的均質な組織(腎臓など)を含み、パラフィンを浸透させても、固化したパラフィンのみ(組織を含まない)の固さと同様になります。高密度または繊維状の組織、または硬組織と軟組織の両方が別々の層に存在する標本は、固化したワックスによって一部が十分にサポートされていないため、多くの問題を引き起こす可能性があります。固定および処理中に生じるブロック内のさまざまな成分の収縮の差が問題の原因であり、薄切時にこれらの問題を経験することになる可能性があります。

参考文献

  1. Clayden EC. Practical section cutting and staining. . Edinburgh: Churchill Livingstone, 1971.
  2. Hopwood D. Fixation and fixatives. In Bancroft J and Stevens A eds. Theory and practice of histological techniques. New York: Churchill Livingstone, 1996.
  3. Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 2007.
  4. Winsor L. Tissue processing. In Woods A and Ellis R eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.2-1 - 4.2-39.

処理と包埋の改善手順

患者から病理医まで、組織学的検査のために組織標本を作製するには、注意、スキル、および適切な手順が必要です。「より良い組織学的検査のための101のステップ」では、一般的なエラーを回避する技術のベストプラクティスと簡単な方法に関する実践的なアドバイスを提供しています。

このガイドでは、組織処理と包埋を改善するためのヒントを明示します。各手順が、良い組織学的検査を行う上での重要な注意喚起となり、好ましくない結果が発生した場合のトラブルシューティングとしてお役立ていただけることを願っています。

「より良い組織学的検査のための101のステップ」は

こちら  からダウンロードいただけます。

ステップ20 - 適切なスケジュールを使用する

組織の種類とサイズに応じて適切なスケジュールを選択します。

不適切なスケジュールが選択されています。たとえば、小さな内視鏡生検に対する非常に長いスケジュールや、大きな脂肪の多い乳房標本に対する非常に短いスケジュールなどです。

この顕微鏡写真は、脂肪の多い大きな標本由来の皮下組織の小領域ですが、処理不足の影響を示しています。線維脂肪組織は十分にサポートされていないので、断片化されています。、一方、腺の上皮組織は、核の鮮明度がなく、残留する溶媒が原因で奇妙な染色(HE)を示しています。
この内視鏡下生検は過剰処理されており、非常に壊れやすくなっています。その結果、多くの細かい亀裂が切片全体に見えます。不十分なミクロトームの技術は問題を悪化させます(HE染色)。

ステップ21-固定を追加する

最適な処理と良好な組織形態を得るためには、処理前に組織をしっかり固定する必要があります。標本が完全に固定されていない場合、ホルマリン固定を処理スケジュールに追加します。

固定が不完全であった標本は、直接アルコールに移し、不均一な固定を生じさせます(標本の外側はホルマリンで固定され、より深い領域はアルコールで固定されています)。

この顕微鏡写真は、骨髄穿刺(HE染色)の切片に対するゾーン固定の影響を示しています。左上の部分では赤血球は無傷ですが、一方、下の部分では溶血しています。
この顕微鏡写真は、トリクローム染色された肝臓の低倍率像を示しています。標本の外側ゾーンの染色結果は、内側の染色結果と異なります。

ステップ22 - 試薬の品質を維持する

処理試薬は、確立されたガイドラインに従って厳密に交換します(理想的には、ライカのPELORISなどの高度なティッシュプロセッサーの試薬管理システムを使用して)。

処理試薬の交換に関するガイドラインが無視されています。つまり、効果のない、汚染された、または希釈された試薬が使用されています(例えば、PELORIS試薬管理システムからの「閾値を超えています」という警告が無視されています)。これにより、処理品質が低下する可能性があります。

大きな皮膚標本由来のこの切片における高密度のコラーゲンの保存不良は、不適切な処理によるものです。この場合、「閾値を超えて」増加した汚染試薬を使用したためだと考えられます。

ステップ23 - 高品質のワックスを使用する

高品質のワックスを、浸透、特に包埋(ブロックアウト)に使用し、切断しやすい高品質のブロックを確保します。

あまり知られていない供給源からの安価で質の悪いワックスを浸透と包埋に使用します。低品質のワックスは、薄切が難しいブロックを生成します。

ブロックが冷たい時に、切片のリボンをこのブロックからゆっくりと薄切しました。低温であったにもかかわらず、切片はかなり圧縮されています。ここでは、質の悪いワックスが適切に組織をサポートできませんでした。

ステップ24 - 危険な試薬を避ける

可能な場合は、キシレンを使わないプロトコルを用います(Leica BiosystemsのPELORISを使用するときに利用可能なプロトコルなど)。これにより、処理品質を損なうことなく、より安全な検査室の環境が得られます。

キシレンの使用による健康への影響が考慮されていない。代替案を使用する可能性が考慮されていない。

キシレンを使わない処理により、品質を維持しながら検査室の安全性を向上させることができます。

ステップ25 - 標本の向きを注意深く調整する

標本の向きを注意深く調整します。十分な切り出しにより、ほとんどの試料で平坦な表面が保証されます。包埋を実行するスタッフは、各標本の記述をすぐに参照でき、適切にトレーニングされています。

包埋の向きが間違っています。再包埋が必要になるため、組織が失われる可能性があります。切り出しが不十分な標本では、必要な部位の切片を取得するためにミクロトームで広範なトリミングを必要とする場合があります。

この内視鏡生検の向きは正しくなく、粘膜の表面レベルしか見えません。

ステップ26 - 適切なモールドを選択する

常に各標本に適したサイズのモールドを選択します。

すべての標本に同じモールドサイズを使用します。組織がモールドの端に触れることがよくあります。

この標本に用いたモールドは小さすぎました。標本がブロックの端に接触しているため、薄切が難しい可能性があります。
さまざまな大きさの標本に対して、さまざまな大きさのモールドが用意されています。

ステップ27 - 標本を丁寧に取り扱う

包埋時には標本を丁寧に取り扱います。

 

標本は、包埋時に、モールド内に平らに置くために、乱雑に処理されています。このプロセスによって組織が割れる場合があります。

包埋中に標本をモールドのベースに平らに置こうとした際に割れた、HE染色された脾臓の切片。

ステップ28 - 過度の熱を避ける

組織を取り扱う前に、パラフィンの融解温度と同じ温度までピンセットを加熱します。

ピンセットはパラフィンワックスの融点をはるかに超えて加熱されています。これにより、接触点に近いところで局所的な熱損傷や形態の変化が起こる可能性があります。

この顕微鏡写真は、肝臓(HE)切片の表面を示しています。包埋中に組織に熱が加えられたことにより、極度の局所的な損傷(組織がほとんど認識できなくなります)が発生しました。

ステップ29 - 定期的に温度を確認する

包埋センターのホットプレートとパラフィンワックスリザーバーの温度を定期的にチェックします。

包埋センターのホットプレートの温度をチェックしたことがありません。この処理段階でも、標本は局所的な過度の熱によって損傷する可能性があります。

このリンパ節は、包埋センターのホットプレートの過熱により損傷しました。縮んで濃縮した核と広範な亀裂に注目してください。このような亀裂は、温度が高すぎるウォーターバスでの浮遊や脱水不十分な状態でのホットプレートによる乾燥によっても生じます。

ステップ30 - モールドに過剰充填しない

モールドは最適レベルまで充填され、オーバーフローしていません。

モールドが過剰に充填されているため、ミクロトーム(薄切)の前にカセットの背面と端をこすり落とす必要があります。過剰充填されたブロックは、ミクロトームチャックにまっすぐに取り付けられない可能性があり、これが不安定性の原因となり、薄切中に組織が損傷を受ける可能性があります。

標本を検査室に送る場合、優先順位は重要です。これは、凍結切片の場合に特に当てはまります。

「より良い組織学的検査のための101のステップ」は 
こちら  からダウンロードしていただけます。

 

この記事の原文はこちら

References

1. Clayden EC. Practical section cutting and staining. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1971.

2. Hopwood D. Fixation and fixatives. In Bancroft J and Stevens A eds. Theory and practice of histological techniques. New York: Churchill Livingstone, 1996.

3. Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 2007.

4. Winsor L. Tissue processing. In Woods A and Ellis R eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.2-1 - 4.2-39.

本記事は、原文が英語の記事の翻訳であり、英語版と日本語版に何らかの齟齬があった場合、 英語版が優先するものといたします。

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