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Fijación y Fijadores: soluciones de fijadores populares

En esta cuarta parte de la serie de Fijación y Fijadores, analizamos algunas de las muchas soluciones de fijación populares y tradicionales que se han utilizado en histología durante los últimos 100 años. Esta parte también incluye una visión general de las soluciones patentadas y proporciona consejos sobre cómo seleccionar el fijador adecuado para su aplicación.

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Soluciones de fijadores populares

A continuación se muestran algunas de las soluciones de fijadores más populares y tradicionales (haga clic en cada línea para obtener más información). Esta no es en absoluto una lista completa, pues durante los últimos cien años o más se han publicado literalmente cientos de variaciones de fijadores y mezclas de fijadores. Los que hemos elegido son simplemente representativos de los principales grupos. Algunos de estos reactivos pueden adquirirse listos para usar a proveedores.1-4

  1. Formol tamponado con fosfato
  2. Calcio formol
  3. Solución salina formolada
  4. Formol-zinc (sin tampón)
  5. Fijador de Zenker
  6. Fijador de Helly
  7. Fijador B-5
  8. Solución de Bouin
  9. Solución de Hollande
  10. Solución de Gendre
  11. Solución de Clarke
  12. Solución de Carnoy
  13. Methacarn
  14. Formol alcohólico
  15. Formol acético alcohol
Figura 1: “Concentrado” disponible comercialmente que, después de la dilución con agua, produce una solución neutra de formol tamponado.
Figura 1: Imagen de un “concentrado” disponible comercialmente que, después de la dilución con agua, produce una solución neutra de formol tamponado.

1. Formol tamponado con fosfato

Formulación

  • Formaldehído al 40 %: 100 ml
  • Agua destilada 900 ml
  • Dihidrogenofosfato de sodio monohidrato: 4 g
  • Di-sodio hidrógeno fosfato anhidro 6,5 g
  • La solución debe tener un pH de 6,8
  • Tiempo de fijación: 12 – 24 horas

Aplicaciones recomendadas

El fijador basado en formaldehído más utilizado para la histopatología rutinaria. El tampón tiende a prevenir la formación de pigmento de formol. Muchos epítopos requieren la recuperación de antígenos para lograr una IHC satisfactoria después de su uso. La mayoría de los patólogos se sienten cómodos interpretando la morfología producida con este tipo de fijador.

2. Calcio formol

Formulación

  • Formaldehído al 40 %: 100 ml
  • Cloruro de calcio: 10 g
  • Agua destilada 900 ml
  •  Tiempo de fijación: 12 – 24 horas

Aplicaciones recomendadas

Recomendado para la conservación de lípidos, especialmente fosfolípidos.

3. Solución salina formolada

Formulación

  • Formaldehído al 40 %: 100 ml
  • Cloruro sódico: 9 g
  • Agua destilada 900 ml
  • Tiempo de fijación: 12 – 24 horas

Aplicaciones recomendadas

Esta mezcla de formaldehído en solución salina isotónica se utilizó ampliamente para histopatología rutinaria antes de la introducción del formol tamponado con fosfato. Suele producir pigmento de formol.

4. Formol-zinc (sin tampón)

Formulación

  • Sulfato de zinc: 1 g
  • Agua desionizada: 900 ml
  • Remover hasta que se disuelva y después añadir –
  • Formaldehído al 40 %: 100 ml
  • Tiempo de fijación: 4 – 8 horas

Aplicaciones recomendadas

Las soluciones de formol-zinc se idearon como alternativas a las formulaciones de cloruro de mercurio. Se dice que ofrecen mejores resultados con IHC. Hay una serie de fórmulas alternativas disponibles, algunas de las cuales contienen cloruro de zinc, que se cree que es ligeramente más corrosivo que el sulfato de zinc.

5. Fijador de Zenker

Formulación

  • Agua destilada: 950 ml
  • Cloruro de mercurio: 50 g
  • Dicromato de potasio: 25 g
  • Ácido acético glacial: 50 ml
  • Tiempo de fijación: 4 – 24 horas

Aplicaciones recomendadas

Proporciona una buena conservación nuclear, pero destruye los glóbulos rojos debido a la presencia de ácido acético. Se ha recomendado para muestras congestionadas y da buenos resultados con tinción PTAH y tricrómica. Produce pigmento de mercurio que debe eliminarse de las secciones antes de la tinción y puede producir pigmento de cromo si el tejido no se lava con agua antes del procesamiento. Es un agente intolerante, por lo que, después del lavado con agua, el tejido debe almacenarse en etanol al 70 %.

6. Fijador de Helly

Formulación

  • Agua destilada 1000 ml
  • Dicromato de potasio: 25 g
  • Sulfato de sodio: 10 g
  • Cloruro de mercurio: 50 g
  • Añada inmediatamente antes de su uso:
  • Formaldehído al 40 %: 50 ml
  • Tiempo de fijación: 4 – 24 horas

Aplicaciones recomendadas

Se considera excelente para la médula ósea, la hematopoyesis extramedular y los discos intercalados del músculo cardíaco.

Produce pigmento de mercurio que debe eliminarse de las secciones antes de la tinción y puede producir pigmento de cromo si el tejido no se lava con agua antes del procesamiento. Es un agente intolerante, por lo que, después del lavado con agua, el tejido debe almacenarse en etanol al 70 %. Debido al pH bajo de este fijador, también puede producirse un pigmento de formol.

7. Fijador B-5

Formulación

Solución madre

  • Cloruro de mercurio: 12 g
  • Acetato sódico anhidro: 2,5 g
  • Agua destilada: 200 ml

Solución de trabajo, preparar inmediatamente antes del uso

  • Solución madre de B-5: 20 ml
  • Formaldehído al 40 %: 2 ml
  • Tiempo de fijación: 4 – 8 horas

Aplicaciones recomendadas

A pesar de su contenido de mercurio y los consiguientes problemas con la eliminación, este fijador es popular para la fijación de tejidos hematopoyéticos y linfoides. Produce un excelente detalle nuclear, proporciona buenos resultados con muchas tinciones especiales y se recomienda para la IHC. El pigmento de mercurio deberá eliminarse de las secciones antes de la tinción. El tejido no debe almacenarse en este fijador, sino en etanol al 70 %.

8. Solución de Bouin

Formulación

  • Solución acuosa saturada con ácido pícrico (al 2,1 %): 750 ml
  • Formaldehído al 40 %: 250 ml
  • Ácido acético glacial: 50 ml
  • Tiempo de fijación: 4 – 18 horas

Aplicaciones recomendadas

Ofrece muy buenos resultados con tejidos que posteriormente vayan a someterse a una tinción tricrómica. Conserva bien el glucógeno pero normalmente destruye los eritrocitos. Recomendado en ocasiones para biopsias del tracto gastrointestinal, embriones animales y tejido de la glándula endocrina. Tiñe el tejido de color amarillo brillante debido al ácido pícrico. El exceso de ácido pícrico debe lavarse de los tejidos antes de la tinción con etanol al 70 %. Debido a su naturaleza ácida, elimina lentamente pequeños depósitos de calcio y de hierro.

9. Solución de Hollande

Formulación

  • Acetato de cobre: 25 g
  • Ácido pícrico: 40 g
  • Formaldehído al 40 %: 100 ml
  • Ácido acético: 15 ml
  • Agua destilada 1000 ml

 Disuelva los productos químicos en agua destilada sin calor.

  •  Tiempo de fijación:               4 – 18 horas

Aplicaciones recomendadas

Recomendado para muestras del tracto gastrointestinal y fijación de tejidos endocrinos. Produce menos lisis que los fijadores de Bouin. Tiene algunas propiedades de descalcificación.

El fijador debe retirarse de los tejidos si se van a poner en formol tamponado con fosfato en la máquina de procesamiento, ya que se formará un precipitado de fosfato insoluble.

10. Solución de Gendre

Formulación

  • Etanol al 95 % saturado con ácido pícrico: 800 ml
  • Formaldehído al 40 %: 150 ml
  • Ácido acético glacial: 50 ml
  • Tiempo de fijación: 4 – 18 horas

Aplicaciones recomendadas

Es una solución de Bouin alcohólica que parece mejorar con el envejecimiento. Es muy recomendable para la conservación del glucógeno y otros carbohidratos. Después de la fijación, el tejido se coloca en etanol al 70 %. El color amarillo residual debe lavarse antes de la tinción.

11. Solución de Clarke

Formulación

  • Etanol (absoluto): 75 ml
  • Ácido acético glacial: 25 ml
  • Tiempo de fijación: 3 – 4 horas

Aplicaciones recomendadas

Se ha utilizado en secciones y frotis congelados. Puede producir buenos resultados después del procesamiento convencional, siempre que el tiempo de fijación sea muy corto. Conserva los ácidos nucleicos, pero se extraen los lípidos. Los tejidos pueden transferirse directamente a etanol al 95 %.

12. Solución de Carnoy

Formulación

  • Etanol absoluto: 60 ml
  • Cloroformo: 30 ml
  • Ácido acético glacial: 10 ml
  • Tiempo de fijación: 1 – 4 horas

Aplicaciones recomendadas

Actúa rápidamente, proporciona una buena conservación nuclear y retiene el glucógeno. Destruye los eritrocitos y disuelve los lípidos, y puede producir un endurecimiento y una contracción excesivos.

13. Methacarn

Formulación

  • Metanol absoluto: 60 ml
  • Cloroformo: 30 ml
  • Ácido acético glacial: 10 ml
  • Tiempo de fijación: 1 – 4 horas

Aplicaciones recomendadas

Propiedades similares a la del fijador de Carnoy, pero causa menos contracción y endurecimiento.

14. Formol alcohólico

Formulación

  • Formaldehído al 40 %: 100 ml
  • Etanol al 95 %: 900 ml
  • Se pueden añadir 0,5 g de acetato de calcio para garantizar la neutralidad
  • Tiempo de fijación: 12 - 24 horas

Aplicaciones recomendadas

Combina un fijador desnaturalizante con los efectos aditivos y de reticulación del formol. A veces se utiliza durante el procesamiento para completar la fijación después de una fijación primaria incompleta con formol. Se puede utilizar para la fijación o posfijación de grandes muestras grasas (en particular, de las mamas) porque permitirá que los ganglios linfáticos se detecten más fácilmente al limpiar y extraer los lípidos. Si se utiliza para la fijación primaria, las muestras pueden colocarse directamente en etanol al 95 % para su procesamiento.

15. Formol acético alcohol

Formulación

  • Etanol absoluto: 85 ml
  • Formaldehído al 40 %: 10 ml
  • Ácido acético glacial: 5 ml
  • Tiempo de fijación: 1 – 6 horas

Aplicaciones recomendadas

Un agente de acción más rápida que el formol alcohólico debido a la presencia de ácido acético, que también puede producir pigmento de formol. A veces se utiliza para corregir secciones de criostato para diagnóstico. Si se utiliza para la fijación primaria, las muestras pueden colocarse directamente en etanol al 95 % para su procesamiento.

Soluciones de fijadores patentados

Durante los últimos años se ha desarrollado un número cada vez mayor de fijadores patentados para su uso en histopatología e investigación médica. Por lo general, se comercializan como sustitutivos menos peligrosos de los fijadores de formol tradicionales o como sustitutos menos tóxicos de las mezclas de fijadores que contienen mercurio, como B5.

Aunque es obligatorio proporcionar una hoja de datos de seguridad del material, la composición exacta de estos reactivos no se suele publicar y un posible usuario tiene que conformarse con una descripción general del reactivo. Los recomendados como sustitutos de los reactivos B5 y de Zenker (que se utilizan habitualmente para fijar tejidos linfoides y hematopoyéticos) normalmente contienen sales de zinc o bario y un bajo porcentaje de formaldehído, mientras que los sustitutos directos de formol suelen contener glioxal y otros componentes. En el último grupo se encuentran los reactivos recomendados para la fijación asistida por microondas (consulte la Parte 5). Algunas fórmulas incluyen etanol, metanol e isopropanol.5

Figura 2: Dos ejemplos de soluciones fijadoras patentadas. Según el fabricante, “Fix-All”, que contiene alcohol, cloruro de bario y formol al 10 %, se recomienda para la fijación de todo tipo de tejidos y como sustituto del fijador B-5, el cual contiene mercurio. “O-Fix” contiene alcohol, formol y ácido acético y también se puede utilizar para fijar todo tipo de tejidos, pero se recomienda especialmente para resaltar los ganglios linfáticos durante la disección.
Figura 2: Dos ejemplos de soluciones de fijadores patentados: Fix-All y O-Fix de Surgipath. Según el fabricante, “Fix-All”, que contiene alcohol, cloruro de bario y formol al 10 %, se recomienda para la fijación de todo tipo de tejidos y como susti

¿Qué fijador debería usar?

En la mayoría de los laboratorios establecidos, ya se ha elegido y utilizado un fijador o fijadores de rutina durante un tiempo considerable en una variedad de tipos de muestras. El patólogo, histólogo o investigador estará completamente acostumbrado a interpretar la morfología característica del tejido producida por un fijador y un programa de procesamiento concretos. Con mayor frecuencia, el fijador de rutina será formol tamponado neutro con otros agentes utilizados para trefinas de médula ósea (quizás formol-zinc), biopsias renales, secciones congeladas, etc. El formol tamponado se utiliza ampliamente porque es probablemente el agente más flexible. Se puede incorporar al programa de procesamiento en procesadores de tejido cerrados. Permite la aplicación con éxito de una amplia gama de tinciones especiales. Los métodos de inmunohistoquímica, que generalmente incluyen un paso de recuperación antigénica, se han optimizado para tejidos fijados en formol, y las muestras de tejido se pueden almacenar en formol durante períodos prolongados sin efectos perjudiciales importantes. También se han validado técnicas moleculares como la ISH para su uso en tejido fijado con formol. Ante estas características, debe considerarse un fijador nuevo o de sustitución5-6

Algunos laboratorios buscan actualmente sustituir el formol por un reactivo menos tóxico, y existen varias alternativas que ya se han descrito en los párrafos anteriores. En un entorno de investigación, en el que se está estudiando un elemento tisular específico, puede haber más control sobre el paso de fijación y merece la pena probar varios reactivos antes de tomar una decisión final. Si está contemplando un cambio de fijador, tenga en cuenta las siguientes propiedades además de evaluar los resultados que vea en el microscopio:

  • Toxicidad del fijador (tanto a corto plazo como acumulada)
  • La volatilidad de sus componentes y el equipo disponible para evitar la exposición del personal al agente
  • Inflamabilidad
  • El efecto de una fijación excesiva en los tejidos (¿daña una fijación prolongada los tejidos?)
  • Requisitos de almacenamiento si las muestras no se pueden dejar en el fijador
  • La compatibilidad del fijador con su procesador de tejidos (¿podría dañar los componentes?)
  • Los requisitos prácticos y legales para la eliminación después del uso

El cambio a un fijador diferente requiere un estudio cuidadoso y una evaluación exhaustiva.

References

  1. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol 2001;24;173 -190.
  2. Leong AS-Y. Fixation and fixatives. In Woods AE and Ellis RC eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.1-1 - 4.1-26.
  3. Hopwood D. Fixation and fixatives. In Bancroft J and Stevens A eds. Theory and practice of histological techniques. New York: Churchill Livingstone, 1996.
  4. Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 2007.
  5. Titford ME, Horenstein MG. Histomorphologic Assessment of Formalin Substitute Fixatives for Diagnostic Surgical Pathology. Arch Pathol Lab Med 2005;129;502-506.
  6. Kothmaier H, Rohrer D, Stacher E, Quehenberger F, Becker K-F, Popper HH. Comparison of Formalin-free Tissue Fixatives: A Proteomic Study Testing Their Application for Routine Pathology and Research. Arch Pathol Lab Med 2011;135;744-752.

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