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Una introducción al procesamiento de muestras

Información general

El análisis microscópico de células y tejidos requiere la preparación de secciones (cortes) muy finas y de alta calidad montadas en portaobjetos de vidrio y teñidas adecuadamente para mostrar las estructuras normales y las anómalas.

La mayoría de los tejidos frescos son muy delicados y se distorsionan y dañan fácilmente, por lo que es imposible preparar secciones finas a menos que se conserven químicamente o “se fijen” y se soporten de algún modo mientras se cortan. En términos generales, hay dos estrategias que se pueden emplear para proporcionar este soporte:

El análisis microscópico de células y tejidos requiere la preparación de secciones (cortes) muy finas y de alta calidad montadas en portaobjetos de vidrio y teñidas adecuadamente para mostrar las estructuras normales y las anómalas.

La mayoría de los tejidos frescos son muy delicados y se distorsionan y dañan fácilmente, por lo que es imposible preparar secciones finas a menos que se conserven químicamente o “se fijen” y se soporten de algún modo mientras se cortan. En términos generales, hay dos estrategias que se pueden emplear para proporcionar este soporte:

Procesador de tejidos cerrado moderno
Imagen de un moderno procesador
Los procesadores "dip and dunk" siguen siendo una buena opción para laboratorios más pequeños.
de tejido incluido Imagen de un procesador "dip and dunk", estos siguen siendo una buena opción para laboratorios más pequeños.
  1. Podemos congelar el tejido y mantenerlo congelado mientras cortamos las secciones. Estas secciones se denominan “secciones congeladas”.
  2. Alternativamente, podemos infiltrar las muestras de tejido con un agente líquido que posteriormente puede convertirse en un sólido que tiene propiedades físicas apropiadas, las cuales permitirán cortar secciones finas de él. La cera de parafina es un agente de este tipo. Esto produce las llamadas “secciones de parafina”.

Este artículo describe el método para procesar tejido para crear muestras incluidas en parafina listas para el corte.

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Introducción

El “procesamiento tisular” describe los pasos necesarios para llevar el tejido animal o humano de la fijación al estado en el que se infiltra completamente con una parafina histológica adecuada y puede incluirse para dejarlo listo para ser cortado en el micrótomo.

El procesamiento de tejido puede realizarse manualmente (procesamiento manual), pero cuando se deben tratar varias muestras, es más cómodo y mucho más eficiente utilizar una máquina de procesamiento de tejidos automatizada (un “procesador de tejidos”). Estos dispositivos han estado disponibles desde la década de 19401 y han evolucionado lentamente para aumentar su seguridad de uso, manejar un mayor número de muestras, aumentar la velocidad de procesamiento y producir mejores resultados de calidad. Existen dos tipos principales de procesadores: las máquinas de transferencia de tejidos (o “dip and dunk”) en las que las muestras se transfieren de un recipiente a otro para ser procesadas, y las de transferencia de fluidos (o “encerradas”), en las que las muestras se mantienen en una única cámara o retorta de procesamiento en la que los fluidos se hacen entrar y salir según sea necesario. La mayoría de procesadores modernos de transferencia de fluidos emplean temperaturas elevadas, una circulación del fluido eficaz e incorporan ciclos de vacío/presión para mejorar el procesamiento y reducir los tiempos de procesamiento.

Procesador de tejidos cerrado moderno

Procesador de tejidos cerrado moderno
Los procesadores "dip and dunk" siguen siendo una buena opción para laboratorios más pequeños.
Los pacientes dependen de un procesamiento de tejidos de calidad
Imagen del médico y del paciente que ilustra cómo los pacientes confían en el procesamiento de tejidos de calidad

La importancia del procesamiento de tejidos

La mayoría de los supervisores de laboratorio insisten entre su personal en la importancia del procesamiento de tejidos. Cabe destacar que el uso de un programa de procesamiento inadecuado o la realización de un error fundamental (quizás en la reposición o secuenciación de los reactivos de procesamiento) puede dar lugar a la producción de muestras de tejido que no pueden cortarse y, por tanto, no proporcionarán ninguna información microscópica útil. Esto puede ser desastroso si se trata de tejido humano de diagnóstico en el que se ha procesado toda la muestra (“all in”). No hay tejido de sobra. No hay diagnóstico. Sin embargo, hay un paciente al que se le debe proporcionar una explicación.

Aunque ocasionalmente se producen fallos mecánicos o eléctricos en los procesadores de tejidos, los contratiempos de procesamiento en los que los tejidos se ven realmente comprometidos se producen principalmente debido a errores humanos. Es importante enfatizar el valor de una educación y formación adecuadas de aquellos que llevan a cabo el procesamiento de tejidos y la necesidad de aplicar un especial cuidado al configurar un procesador para cualquier procesamiento.

Descripción general de los pasos del procesamiento de tejidos para secciones de parafina

1. Obtención de una muestra fresca

Las muestras de tejido fresco procederán de varias fuentes. Debe tenerse en cuenta que pueden dañarse con mucha facilidad durante la retirada del paciente o del animal experimental. Es importante que se manipulen con cuidado y se fijen adecuadamente lo antes posible después de la disección. De forma ideal, la fijación debe tener lugar en el lugar de la extracción, quizás en el quirófano, o, si no es posible, inmediatamente después del transporte al laboratorio.

2. Fijación

La muestra se coloca en un agente fijador líquido (fijador), como una solución de formaldehído (formol). Este penetrará lentamente en el tejido, causando cambios químicos y físicos que endurecerán y conservarán el tejido y lo protegerán frente a los pasos de procesamiento posteriores.2 Hay un número limitado de reactivos que se pueden utilizar para la fijación, ya que deben poseer propiedades particulares que los hagan adecuados para este fin. Por ejemplo, los componentes tisulares deben conservar cierta reactividad química para que puedan aplicarse posteriormente técnicas de tinción específicas.3 El formol, normalmente como solución tamponada con fosfato, es el fijador más popular para preservar tejidos que se procesarán para preparar secciones de parafina. Lo ideal es que las muestras permanezcan en el fijador durante el tiempo suficiente para que el fijador penetre en cada parte del tejido y luego durante un período adicional para permitir que las reacciones químicas de la fijación alcancen el equilibrio (tiempo de fijación). Por lo general, esto significa que la muestra debe fijarse entre 6 y 24 horas. La mayoría de los laboratorios utilizarán un paso de fijación como primera estación en su procesador.

Tras la fijación, es posible que las muestras requieran una disección adicional para seleccionar las zonas adecuadas para el examen. Las muestras que se vayan a procesar se colocarán en casetes (pequeñas cestas perforadas) debidamente etiquetados para separarlas de otras muestras. La duración del programa de procesamiento utilizado para procesar las muestras dependerá del tipo y las dimensiones de las muestras más grandes y más pequeñas, el procesador en particular empleado, los disolventes elegidos, las temperaturas de los disolventes y otros factores. El siguiente ejemplo se basa en un programa de seis horas adecuado para su uso en un procesador de tejidos rápido Peloris™ de Leica.

3. Deshidratación

Debido a que la cera de parafina derretida es hidrófoba (inmiscible con agua), la mayor parte del agua de una muestra debe eliminarse antes de que pueda infiltrarse con parafina. Este proceso se lleva a cabo habitualmente sumergiendo las muestras en una serie de soluciones de etanol (alcohol) de concentración creciente hasta que se alcanza alcohol puro sin agua. El etanol es miscible con agua en todas las proporciones, para que el agua de la muestra sea sustituida progresivamente por el alcohol. Se utiliza una serie de concentraciones crecientes de alcohol para evitar un deterioro excesivo del tejido.

Una secuencia de deshidratación típica para muestras de no más de 4 mm de grosor sería la siguiente:

  1. Etanol al 70 %      15 min
  2. Etanol al 90 %      15 min
  3. Etanol al 100 %    15 min
  4. Etanol al 100 %    15 min
  5. Etanol al 100 %    30 min
  6. Etanol al 100 %    45 min

En este punto, todo menos un pequeño residuo de agua (molecular) fuertemente unido debería haberse eliminado de la muestra.

4. Aclaramiento

Desafortunadamente, aunque ahora el tejido está esencialmente libre de agua, todavía no podemos infiltrarlo con parafina porque la parafina y el etanol son en gran medida inmiscibles. Por lo tanto, tenemos que utilizar un disolvente intermedio que sea totalmente miscible con etanol y cera de parafina. Este disolvente desplazará el etanol en el tejido y, a continuación, este, a su vez, será desplazado por cera de parafina fundida. Esta etapa del proceso se denomina “aclarado” y el reactivo utilizado se denomina “agente aclarante”. Se acuñó el término "aclaramiento" porque muchos (si bien no todos) agentes aclarantes dan claridad o transparencia óptica al tejido debido a su índice de refracción relativamente elevado. Otro papel importante del agente aclarante es eliminar una cantidad importante de grasa del tejido que, de otro modo, supondría una barrera para la infiltración de parafina.

Un agente aclarante popular es el xileno, y se requieren múltiples cambios para desplazar completamente el etanol.

Una secuencia de aclarado típica para muestras de no más de 4 mm de grosor sería la siguiente:

  1. xileno   20 min
  2. xileno   20 min 
  3. xileno   45 min

5. Infiltración de parafina

El tejido ahora puede infiltrarse con una parafina histológica adecuada. Aunque se han evaluado y utilizado muchos reactivos diferentes para este propósito a lo largo de muchos años, las ceras histológicas basadas en parafina son las más populares. Una parafina típica es líquida a 60 °C y puede infiltrarse en el tejido a esta temperatura y luego dejarse enfriar hasta 20 °C, temperatura a la que se solidifica hasta adoptar una consistencia que permite cortar las secciones uniformemente. Estas ceras son mezclas de parafina purificada y varios aditivos que pueden incluir resinas tales como estireno o polietileno. Debe observarse que estas formulaciones de parafina tienen propiedades físicas muy particulares que permiten que los tejidos infiltrados con la parafina se seccionen a un grosor de 2 μm o menos para formar cintas a medida que las secciones se cortan en el micrótomo y para conservar suficiente elasticidad para aplanarse completamente durante la flotación en un baño de agua caliente.

Una secuencia de infiltración típica para muestras de no más de 4 mm de grosor sería:

  1. parafina      30 min
  2. parafina      30 min
  3. parafina      45 min

  6. Inclusión o formación de bloque

Ahora que la muestra se ha infiltrado correctamente con parafina, debe formarse en un “bloque” que pueda fijarse en un micrótomo para proceder al corte. Este paso se lleva a cabo utilizando un “centro de inclusión”, donde un molde se llena con parafina fundida y la muestra se coloca en él. La muestra está muy cuidadosamente orientada en el molde porque su colocación determinará el “plano de corte”, una consideración importante tanto en el diagnóstico como en la histología de investigación. Se coloca un casete encima del molde, se rellena con más parafina y todo se coloca sobre una placa fría para que se solidifique. Cuando esto se haya completado, el bloque con su casete acoplado se puede retirar del molde y estará listo para la microtomía. Debe tenerse en cuenta que, si el procesamiento del tejido se realiza correctamente, los bloques de parafina que contienen las muestras de tejido son muy estables y representan una fuente importante de material de archivo.

Carga de muestras en un procesador de tejidos
Carga de muestras en un procesador de tejidos
Inclusión
Inclusión

Procesamiento “sin xileno”

Aunque el xileno se utiliza ampliamente como agente aclarante para el tejido, su procesamiento lo convierte en un reactivo tóxico. Algunos laboratorios prefieren utilizar alternativas menos tóxicas, como el isopropanol u otros sustitutos del xileno. Para que este método tenga éxito, se requieren temperaturas de la parafina más altas para que el isopropanol pueda eliminarse de las muestras durante la infiltración.

El efecto del procesamiento de tejidos en las muestras

El procesamiento de tejidos de alta calidad es fundamental para un diagnóstico preciso
Patólogo examinando una preparación para ilustrar cómo el procesamiento de tejidos de alta calidad es fundamental para un diagnóstico preciso

Los efectos combinados de la fijación y el procesamiento son el endurecimiento del tejido, y es inevitable que también se produzca una contracción. Se ha estimado que los tejidos se encogen hasta un 20 % o más cuando se infiltran con parafina4. A pesar de estos efectos, las secciones preparadas a partir de tejidos procesados de forma óptima mostrarán sistemáticamente un detalle morfológico excelente, lo que permite realizar comparaciones entre muestras y determinar diagnósticos histopatológicos precisos.

En teoría y en la práctica, los bloques de parafina que serán más fáciles de cortar contendrán tejido relativamente homogéneo de consistencia suave uniforme (como el riñón), que, al infiltrarse con parafina adopta una consistencia similar a la de la parafina solidificada sola (sin contener tejido). Los tejidos de naturaleza densa o fibrosa o una muestra en los que tanto el tejido duro como el blando estén presentes en capas discretas pueden suponer un mayor desafío porque partes de ellos no quedan tan ben fijadas con la parafina solidificada. La contracción diferencial de los distintos elementos de estos bloques durante la fijación y el procesamiento contribuye a los problemas que pueden experimentarse al cortarlos.

Pasos para un mejor procesamiento e inclusión

Desde el paciente hasta el patólogo, la preparación de muestras de tejidos para su examen histológico requiere cuidado, habilidad y un procedimiento delicado. Esta guía proporciona asesoramiento práctico sobre las mejores técnicas, así como formas sencillas de evitar errores comunes.

En esta guía se proporcionan algunos consejos para realizar un mejor procesamiento e inclusión de los tejidos. Esperamos que cada paso proporcione un valioso recordatorio de buenas prácticas histológicas y ayude a solucionar problemas cuando se produzcan resultados inaceptables.

¿Desea ver los 101 pasos para una mejor histología?

Usar un programa apropiado

Se elige un programa apropiado para el tipo y tamaño de tejido.

Se elige un programa inapropiado. Por ejemplo, un programa muy largo para una biopsia endoscópica pequeña o un programa muy corto para una muestra mamaria grande y grasa.

Esta micrografía de una pequeña zona de tejido subcutáneo de una muestra grande y grasa muestra los efectos del procesamiento insuficiente. El tejido fibrograso está mal soportado y, por tanto, fragmentado, mientras que el tejido epitelial de las glándulas muestra una falta de definición nuclear y tinción peculiar debido al disolvente retenido (H&E).
Usar un programa apropiado
Esta biopsia endoscópica se ha procesado excesivamente y se ha vuelto muy quebradiza. En consecuencia, se pueden ver muchas grietas finas en toda la sección. Una técnica de microtomía deficiente agrava el problema (H&E).

Proporcionar fijación adicional

Para un procesamiento óptimo y una buena morfología, el tejido debe fijarse bien antes del procesamiento. Cuando las muestras se fijen incompletamente, se proporciona fijación adicional con formol en el programa de procesamiento.

Las muestras no fijadas completamente van directamente en alcohol que produce fijación zonal (fijación con formol para el exterior de la muestra, fijación con alcohol para zonas más profundas).

Esta micrografía muestra los efectos de la fijación zonal en una sección de aspiración de médula ósea (H&E). En la parte superior izquierda, los glóbulos rojos están intactos, mientras que en la parte inferior están hemolizados.
Proporcionar fijación adicional
Esta micrografía muestra una vista de baja potencia del hígado teñido con una tinción tricrómica. El resultado de la tinción en la zona exterior de la muestra es diferente al de la zona interior.
Proporcionar fijación adicional

Mantener la calidad del reactivo

Los reactivos de procesamiento se sustituyen estrictamente de acuerdo con las directrices establecidas (lo ideal es utilizar un sistema de gestión de reactivos en un procesador de tejidos avanzado, como PELORIS de Leica Biosystems).

Se ignoran las directrices para la colocación de los reactivos de procesamiento, lo que significa que se utilizan reactivos ineficaces, contaminados o diluidos (p. ej., se ignoran las advertencias de “fuera de umbral” del sistema de gestión de reactivos PELORIS). Esto puede provocar una mala calidad de procesamiento.

En esta sección, a partir de una muestra de piel grande, la mala conservación del colágeno denso se debe a un procesamiento inadecuado. En este caso, creemos que se debió al uso de reactivos muy contaminados, muy “fuera de umbral”.
Mantener la calidad del reactivo

Usar parafina de alta calidad

Se utiliza parafina de alta calidad para la infiltración y especialmente para la inclusión (bloqueo) para garantizar bloques de alta calidad fáciles de cortar.

Se utiliza parafina barata y de mala calidad de fuentes poco conocidas para la infiltración y la inclusión. La parafina de mala calidad produce bloques difíciles de cortar.

Se cortó lentamente una cinta de secciones de este bloque mientras el bloque estaba frío. Las secciones muestran una compresión considerable a pesar de la baja temperatura utilizada. En este caso, la parafina de mala calidad no ha soportado correctamente el tejido.
Usar parafina de alta calidad

Evitar los reactivos peligrosos

Cuando es posible, se utilizan protocolos exentos de xileno (como los disponibles cuando se utiliza PELORIS de Leica Biosystems). Esto proporciona un entorno de laboratorio más seguro sin afectar a la calidad del procesamiento.

No se tienen en cuenta los efectos sobre la salud del uso de xileno. No se ha considerado la posibilidad de utilizar alternativas.

El procesamiento exento de xileno puede mejorar la seguridad del laboratorio a la vez que mantiene la calidad.
Evitar los reactivos peligrosos

Orientar las muestras con cuidado

Las muestras se orientan con cuidado. Un examen macroscópico idóneo garantiza superficies planas en la mayoría de las muestras. El personal que realiza la inclusión tiene acceso inmediato a la descripción de cada muestra y cuenta con la formación adecuada.

La orientación es incorrecta. Esto puede dar lugar a la pérdida de tejido, ya que es necesario volver a realizar la inclusión. Algunas muestras mal preparadas requieren un amplio recorte en el microtomo para obtener una sección de cara completa.

Esta biopsia endoscópica se ha orientado incorrectamente y muestra solo el nivel superficial de la mucosa.
Orientar las muestras con cuidado

Elegir un molde adecuado

Siempre se elige un molde de tamaño adecuado para cada muestra.

Se utiliza el mismo tamaño de molde para todas las muestras. Con frecuencia, el tejido toca el borde del molde.

El molde utilizado para esta muestra era demasiado pequeño. La muestra está en contacto con los bordes del bloque y, por tanto, puede ser difícil de seccionar.
Elegir un molde adecuado
Hay moldes de diferentes tamaños disponibles para diversos tamaños de muestras.
Elegir un molde adecuado

Manipular las muestras con cuidado

Las muestras se manipulan con cuidado durante la inclusión.

Las muestras se manipulan bruscamente durante la inclusión para que queden planas en el molde. Este proceso puede fracturar parte del tejido.

Una sección de bazo teñida con H&E se fracturó durante la inclusión en un intento de hacer que la muestra quedara plana sobre la base del molde.
Manipular las muestras con cuidado

Evitar el calor excesivo

Antes de manipular el tejido, las pinzas se calientan hasta el punto en que la parafina se funde.

Las pinzas se calientan mucho más allá del punto de fusión de la parafina. Esto puede causar daños locales por calor y un cambio en la morfología de la zona cercana al punto de contacto.

Esta micrografía muestra la superficie de una sección del hígado (H&E). El daño local extremo (que hace que el tejido sea casi irreconocible) ha sido provocado por la aplicación de calor al tejido durante la inclusión.
Evitar el calor excesivo

Comprobar las temperaturas con regularidad

La temperatura de la placa calefactora del centro de inclusión y del depósito de parafina se comprueba con regularidad.

La temperatura de la placa calefactora del centro de inclusión no se comprueba nunca. Incluso en esta etapa del procesamiento, las muestras pueden resultar dañadas por un calor local excesivo.

Este ganglio linfático se dañó por el sobrecalentamiento de la placa calefactora del centro de inclusión. Observe los núcleos picnóticos y arrugados y el amplio agrietamiento. Un agrietamiento como este también puede deberse a la flotación en un baño de agua demasiado caliente o al secado en una placa calefactora sin suficiente drenaje.
Comprobar las temperaturas con regularidad

No llenar en exceso los moldes

Los moldes se llenan hasta un nivel óptimo y no se desbordan.

Los moldes se llenan en exceso, lo que requiere raspar la parte posterior y los bordes del casete antes de la microtomía. Los bloques llenados en exceso pueden asentarse de forma desigual en el portaherramientas del microtomo, lo que puede provocar inestabilidad y provocar daños en el tejido durante la microtomía.

Las prioridades son importantes al entregar muestras al laboratorio. Esto es especialmente así cuando se trata de secciones congeladas.
No llenar en exceso los moldes

References

1. Clayden EC. Practical section cutting and staining. Edinburgh: Churchill Livingstone, 1971.

2. Hopwood D. Fixation and fixatives. In Bancroft J and Stevens A eds. Theory and practice of histological techniques. New York: Churchill Livingstone, 1996.

3. Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 2007.

4. Winsor L. Tissue processing. In Woods A and Ellis R eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.2-1 - 4.2-39.

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