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El arte del corte de tejidos congelados

Este artículo describe un sistema utilizado para la inclusión de tejidos en la preparación de secciones congeladas. Este novedoso sistema utiliza técnicas y aparatos sencillos para lograr la inclusión boca abajo en pocillos de acero a temperaturas bajo cero. El sistema es fácil de aprender y ofrece muchas ventajas con respecto a los métodos convencionales, como velocidad, alta precisión y previsibilidad, así como un menor desperdicio de tejido. El sistema se adapta fácilmente a la mayoría de criostatos existentes, no utiliza consumibles adicionales y requiere un mantenimiento mínimo.

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Introducción

Como patólogo practicante, no puedo pensar en ninguna tarea más intimidatoria que preparar e interpretar la sección congelada. Al patólogo, armado solo con unos cuantos frascos de tinción y un criostato, se le pide que determine la futura cirugía de un paciente basándose en una pequeña muestra de tejido. Esta formidable tarea es un baño de realidad. Este sentimiento de cautela se queda con el patólogo a lo largo de toda su carrera. Para proporcionar las respuestas necesarias a las preguntas que se nos hace en la sala de secciones congeladas, hay una serie de pasos que deben realizarse sin fallos. Estos incluyen el examen macroscópico y el muestreo del tejido, la inclusión precisa del tejido, el corte y la tinción de preparaciones de alta calidad y finalmente la interpretación de las preparaciones. En cada uno de estos pasos, una preparación deficiente puede producir resultados desastrosos.

Este artículo trata sobre el proceso de inclusión de tejido para secciones congeladas. Aunque la inclusión en algunos casos es un proceso sencillo en el que la orientación no es crítica, hay muchas muestras en las que nuestra capacidad de proporcionar una respuesta depende de la orientación perfecta de la muestra dentro del bloque.

En criostatos convencionales, el tejido se incluye para el corte de secciones congeladas colocándolo boca arriba en un soporte de tejido y cubriéndolo con un medio de inclusión. A continuación, el soporte de tejido o "mordaza" se ajusta en una barra de temperatura de congelación. Se aplica un disipador de calor a la parte superior del tejido en el momento adecuado para acelerar el proceso de congelación y aplanar la superficie del tejido para crear un plano horizontal. Este sistema tiene muchas deficiencias que pueden crear una frustración considerable. El sistema funciona adecuadamente en situaciones en las que hay un gran volumen de tejido disponible y la orientación precisa no es un problema. Una muestra de tamaño considerable puede incluirse y simplemente recortarse hasta un nivel en el que el operador esté satisfecho con la cara del tejido. Por desgracia, los métodos actuales son inadecuados en un porcentaje significativo de casos en los que es esencial una alta precisión y previsibilidad de la cara del tejido preparado. El resultado pueden ser preparaciones de calidad inferior que requieran un recorte y un desgaste significativo de la muestra de tejido. Puede producirse una distorsión adicional por el aplastamiento del tejido causado por el pesado extractor de calor. Este método de inclusión de tejido, en el mejor de los casos, prepara una aproximación aproximada de lo que es posible con la inclusión en parafina.

El problema se magnifica cuando estamos ante muestras minúsculas y núcleos finos. Puede ser difícil obtener todo el tejido deseado en una sección sin cortar porciones significativas de la muestra. Aún más dificultades surgen cuando tenemos muestras endebles, delgadas y difíciles de manejar que necesitan incluirse en una orientación precisa. Colocar estas muestras en un charco de medio de inclusión congelado y fijarlas en su lugar mientras se está encorvado sobre el criostato es una situación incómoda en muchos niveles.

Los histotécnicos experimentados han ideado una variedad de técnicas y aparatos improvisados en un intento por lograr resultados óptimos. Una de estas técnicas es utilizar mordazas precongeladas revestidas con una capa aplanada de medio de inclusión. Esto da al tejido una superficie plana sobre la que mantenerse en lugar de las rejillas irregulares y los surcos diseñados para agarrar el tejido congelado y el medio que forman la cara de las mordazas. Otros aplanan los tejidos contra una superficie congelada antes de incluirlos boca arriba en una mordaza. Los histotécnicos del área de cirugía de Mohs utilizan una técnica de incisión de la muestra para relajar la piel de modo que esta pueda aplanarse más fácilmente.

El proceso de corte congelado es muy exigente debido a la presión siempre presente para proporcionar un resultado rápido. El estrés aumenta cuando varios cirujanos entregan varias muestras al mismo tiempo. El uso del sistema convencional en criostatos modernos puede tardar 90 segundos o más en congelar un bloque, durante lo cual debemos supervisar la congelación durante el tiempo adecuado para colocar el único extractor de calor sobre el bloque de congelación. Para acelerar el proceso, algunas instituciones se han pasado a medios alternativos de congelación rápida de tejidos, como la inmersión del tejido en nitrógeno líquido u otros líquidos superenfriados. Este rápido proceso reduce los artefactos de congelación, pero tiene una precisión limitada.

Varias mentes innovadoras han reconocido las limitaciones y la frustración relacionadas con los métodos convencionales y han comercializado medios alternativos de inclusión de tejido para secciones congeladas. Estos incluyen herramientas varias, que van desde dispositivos de aplanamiento simples hasta instrumentos complejos y elaborados con la esperanza de proporcionar al usuario un medio más articulado para lograr la orientación adecuada de los tejidos. Hasta ahora, estos productos no han llegado a los corazones de los principales fabricantes de criostatos.

Este artículo describe un sistema que consiste en un aparato simple y técnicas usadas para incluir tejido para sección congelada. El sistema incluye el tejido boca abajo utilizando pocillos de temperatura de congelación que se encuentran en la superficie de barras de acero. Aunque es similar a la inclusión en parafina, el sistema tiene una ventaja distintiva. Esta ventaja es la propiedad física que hace que el tejido se pegue al acero congelado. Esta propiedad facilita la configuración del tejido en los pocillos y hace que sea más fácil que poner tejido de pie en parafina solidificante. Las ventajas que se describirán en este artículo incluyen precisión, previsibilidad, velocidad y reducción del desperdicio de tejido, facilidad para practicar, comodidad y conveniencia.

Materiales y métodos

El aparato descrito en este artículo fue creado por el autor, que es presidente de Pathology Innovations, LLC, de Wyckoff, NJ (EE. UU.) El aparato consta de una serie de componentes, descritos a continuación.

Barras de pocillos de inclusión

La inclusión se realiza en pocillos colocados en la cara de barras de acero inoxidable de 2,54 cm de grosor (Figura 1A). Cuando se enfrían a temperatura criostática, estas barras proporcionan un potente disipador de calor para una congelación rápida. Los pocillos cuentan con paredes biseladas, bordes redondeados y superficies pulidas para facilitar la liberación. En su forma actual, el autor utiliza pocillos cuadrados con esquinas redondeadas de diámetros de 18, 24 y 30 mm a lo largo de la base. Pueden crearse pocillos de diferentes tamaños y profundidades para adaptarse a diferentes situaciones. Las barras de pocillos se almacenan en el punto más profundo y conveniente del criostato, donde las temperaturas son más bajas, y se llevan a una ubicación más alta o más accesible durante el proceso de inclusión. Para este fin, en muchos criostatos se puede instalar un pequeño estante. Una temperatura ambiente del criostato de -23 a -27 °C es ideal para una congelación rápida.

Mordazas

Las mordazas están diseñadas con un patrón de cuadrícula de cruce de canales de corte agudo para maximizar la potencia de agarre requerida para sostener el bloque de tejido incluido (Figura 1B). El ancho y la profundidad de los canales permiten la penetración completa del medio de inclusión cuando se utiliza frío y, por lo tanto, este se puede almacenar a temperaturas de congelación para facilitar una congelación rápida. El patrón de cuadrícula de cruce permite la extrusión del exceso de medio de inclusión para que las mordazas se puedan dejar planas sobre la cara de la barra de pocillos. Las mordazas están hechas de acero inoxidable, lo que aumenta su potencia de congelación y durabilidad, y se almacenan en un contenedor en una ubicación conveniente en la parte baja del criostato. Las mordazas se congelan óptimamente cuando se utilizan en frío, pero también se pueden utilizar calientes con el bloque de congelación sobre mordaza que se describe a continuación. Las mordazas con vástago son las más adecuadas para este proceso. El vástago es el punto focal en el que realizar el toquecito que resultará en una fácil liberación del bloque del pocillo. Estas mordazas se adaptan a muchos de los criostatos de las principales marcas y se pueden utilizar en la mayoría de criostatos mediante un adaptador.

Bloques de congelación sobre mordaza

Los bloques de congelación sobre mordaza hechos de acero rectangular funcionan como un extractor de calor (Figura 1C). Están diseñados para encajar sobre el vástago de la mordaza. El bloque de congelación también sirve como herramienta de desplazamiento. Con un ligero golpecito del vástago de la mordaza se corta el plano de adhesión, sujetando el bloque formado al pocillo. Estos bloques también sirven como una práctica superficie plana de congelación útil en la técnica de enlucido descrita a continuación.

Portaobjetos de dispensación

El fino portaobjetos de dispensación transparente y está hecha de vinilo, y sirve para orientar con precisión el tejido en la posición deseada y como medio para transferir con precisión el tejido al suelo del pocillo de inclusión (Figura 1D). El tejido se coloca al final del portaobjetosde la espátula transparente hacia abajo, donde puede visualizarse desde abajo y manipularse para dejarlo en su posición. La cara visible se colocará en el suelo del pocillo, y será la superficie incluida que se seccionará.

Estante de inclusión

Este estante desmontable de inclusión está diseñado para instalarse en la pared frontal debajo de la abertura del criostato en la ubicación más cómoda y ergonómicamente disponible (Figura 1E). Los estantes están fabricados en varios tamaños para adaptarse a la mayoría de instrumentos. El estante de la ilustración admite tres barras de pocillos con las que se pueden incluir hasta 12 bloques. Las barras de pocillos se pueden utilizar en una superficie cómoda y plana, como un portaescobillas, en criostatos que no sean compatibles con un estante de inclusión.

La técnica

Orientar el tejido en el portaobjetos de dispensación

  1. Humedezca el portaobjetos de dispensación con una capa fina de medio de inclusión (Figura 2A).
  2. Coloque el tejido que se va a incluir boca abajo al final del portaobjetos (Figura 2B).
  3. Observe el tejido a través del portaobjetos transparente. Ajuste el tejido para garantizar la colocación exacta de la cara deseada (Figura 2C).

Colocación del tejido en el pocillo de inclusión

  1. Tire del tejido para solaparlo ligeramente con el portaobjetos de dispensación en aproximadamente 1 mm.
  2. El borde saliente del tejido se coloca en la ubicación deseada en el suelo del pocillo, donde se adhiere al acero frío (Figura 2D).
  3. El portaobjetos de dispensación se extrae de debajo del tejido, que cae y se adhiere al suelo del pocillo. Los tejidos que requieren una orientación precisa pueden manipularse para colocarlos en la posición exacta a medida que se retira lentamente el portaobjetos de dispensación.

Llenado del pocillo con medio de inclusión

Llene el pocillo con medio de inclusión hasta su capacidad máxima de forma que un menisco sobresalga por encima del nivel de la superficie de la barra del pocillo (Figura 2E).

Colocación de la mordaza sobre el pocillo

Presione inmediatamente la mordaza sobre el pocillo dejándola plana sobre la superficie de la barra del pocillo (Figura 2F). Cualquier exceso de medio se extrudirá a través de los canales de la mordaza.

Colocación del bloque de congelación sobre la mordaza

El bloque de congelación sobre la mordaza se coloca sobre el vástago de esta (Figura 2G).

Este es un paso obligatorio cuando se utiliza una mordaza caliente o el pocillo grande de 30 mm.

Periodo de congelación

Las condiciones óptimas de congelación se refieren a barras de pocillos y mordazas completamente refrigerados almacenados en un criostato a -24 °C.

Las condiciones óptimas de congelación son las siguientes: pocillo de 18 mm: 20 seg; pocillo de 24 mm: 35 seg; pocillo de 30 mm: 60 seg. 

Retirada del bloque

Un golpe fuerte del vástago de la mordaza con el bloque de congelación sobre la mordaza libera fácilmente el bloque preparado (Figura 2H y 2I).

Más detalles sobre la técnica

Portaobjetos de dispensación

Los portaobjetos tienen varios anchos de punta. El ancho de la punta se elige en función del tamaño del tejido y del tamaño del pocillo en el que se esté colocando el tejido. Al mirar a través del portaobjetos se obtiene una vista de la cara del tejido que se colocará hacia abajo en el suelo del pocillo. Mientras mira a través de la parte posterior del portaobjetos, el tejido puede ajustarse a la orientación precisa deseada.

Esto puede hacerse para que la epidermis o el margen sean visibles o para colocar un tejido en el borde. A continuación, a medida que el tejido sale del portaobjetos, se dirige para que se adhiera en la posición deseada.

Una fina capa de medio de inclusión garantiza una liberación limpia y fácil del bloque y asegura la adhesión del tejido al suelo del pocillo. Esta capa de medio también proporciona soporte para el tejido, facilitando la manipulación en el portaobjetos de dispensación y proporcionando adhesión al portaobjetos durante el transporte. Si se utiliza un exceso de medio de inclusión, habrá una capa más gruesa de medio congelado que la deseada sobre el tejido incluido. Esto es un problema cuando se requiere una planitud extrema, como cuando se incluyen en horizontal varias muestras diminutas o biopsias por punción. La Figura 3 muestra un ejemplo artístico que requiere una inclusión extremadamente plana. Las muestras en este caso son semillas de sésamo coloreadas. Esto no se podría haber logrado sin el uso de una capa muy fina de medio de inclusión para adherir las semillas de sésamo al suelo del pocillo.

Si no existe riesgo de contaminación cruzada, se pueden colocar varias muestras de tejido en un solo portaobjetos y tirar de ellas hasta el final para colocarlas en uno o más pocillos. Por ejemplo, al tomar muestras de un tumor grande, se pueden colocar cuatro cuadrados de 1 cm en un pocillo de 30 mm. Esto permite que se muestree una cantidad bastante grande de tejido de un único bloque seccionado. Sin embargo, si se estaban examinando muestras separadas, como ganglios linfáticos, de cuatro lugares diferentes, debían utilizarse portaobjetos de dispensación separados para evitar la contaminación cruzada.

Colocación del tejido en el pocillo

Antes de colocar el tejido, debe tenerse en cuenta la orientación y la ubicación del tejido en el pocillo. Si se coloca una gran parte de tejido en el suelo del pocillo, la “zona de contacto” debe estar en un punto del pocillo que permita espacio para toda la pieza. Por ejemplo, si se coloca una longitud de tejido de 2 cm en un pocillo de 30 mm, la zona de contacto debe empezar cerca del borde y no en el medio. Si se colocan cuatro cuadrados de 1 cm en el pocillo de 30 mm, deben colocarse directamente cerca de las paredes, en las esquinas para dejar espacio (Figura 4). Como en toda preparación de cortes congelados, debe tenerse en cuenta la orientación del tejido con respecto a la cuchilla. Por ejemplo, muchos médicos están de acuerdo en que la epidermis debe orientarse perpendicular a la cuchilla al cortar la piel.

El proceso de extraer el portaobjetos de debajo del tejido puede requerir una gran precisión para lograr el resultado final. En muestras que no requieren orientación, el portaobjetos se puede retirar con un movimiento rápido. En muestras que requieren una orientación precisa, este proceso se puede llevar a cabo de forma más lenta y meticulosa. Si la forma de la muestra lo permite, el borde más crítico de la muestra debe ser el primero en entrar en contacto. El portaobjetos puede extraerse lentamente de debajo de la muestra con cuidado, utilizando unas pinzas para guiar el área crítica que debe adherirse al acero en la orientación deseada. Si se está examinando un margen tintado, se puede tener especial cuidado para asegurar que el margen se adhiera primero, después de lo cual se puede abordar la porción restante. En una tira fina de piel de un caso quirúrgico de Mohs, se puede tener mucho cuidado para garantizar que la epidermis se visualice completamente y que la muestra esté incluida en horizontal. Las muestras que requieren un aplanamiento extremo pueden aplanarse usando la parte inferior de unas pinzas anguladas. Los túbulos, como los márgenes de uréter, pueden colocarse fácilmente de tal forma que se adhieran al suelo del pocillo en orientación vertical. Las tiras finas pueden guiarse de forma que el borde se adhiera hacia abajo para la orientación del borde. Los fragmentos membranosos pueden enrollarse o doblarse para colocarse sobre el borde del portaobjetos de dispensación y extraerse e incluirse en la misma orientación. Con un poco de previsión e imaginación, hay infinitas oportunidades para lograr los objetivos de inclusión deseados.

Manipulación de líquidos

Los líquidos y las muestras muy blandas, como los curetajes endometriales y los productos de concepción, pueden rasparse con una cuchara o espátula de plástico y colocarse ordenadamente en pocillos sin artefactos de aplastamiento (figuras 5A y 5B). En muestras líquidas muy sanguinolentas, remover en unas pocas gotas de medio de inclusión permitirá que la porción sanguinolenta se corte con una menor rotura. La Figura 6 muestra un ejemplo de la posible precisión en la manipulación de líquidos con este sistema.

Llenado del pocillo con medio de inclusión y colocación de la mordaza

Debe haber un menisco abultado de medio de inclusión para penetrar los canales en la cara de la mordaza para una unión firme al bloque formado. La mordaza debe colocarse sobre el pocillo lo más rápido posible después del llenado. La mordaza se coloca presionando firmemente la cara de esta contra la superficie de la barra de pocillos. El exceso de medio se extruye a través de las ranuras de las mordazas.

Tiempos de congelación

Los tiempos de congelación recomendados son tiempos aproximados experimentados por el autor cuando las barras de pocillos y las mordazas están completamente refrigeradas. El tiempo de congelación aumentará si se deja que las barras de pocillos se calienten, si se utilizan mordazas calientes o si las muestras son muy gruesas. El usuario desarrolla rápidamente la sensación de saber cuándo el bloque está listo. Las barras de pocillos deben devolverse al nivel inferior del criostato tan pronto como se retiren las mordazas para mantener una temperatura óptima. Las mordazas deben limpiarse, secarse y sustituirse en el criostato lo antes posible para obtener el máximo rendimiento. Hay una variación considerable de la temperatura a diferentes niveles del criostato. El estante de inclusión se instala a un nivel alto para optimizar la capacidad del operador para realizar estas tareas manuales precisas críticas. Las barras de pocillos, las mordazas o los bloques se calentarán por encima de las temperaturas de funcionamiento óptimas si se dejan en el estante durante períodos prolongados.

Manipulación de numerosas muestras

Cuando se tienen numerosas muestras, este sistema permite procesar múltiples bloques muy rápidamente. El portaobjetos de dispensación debe prepararse con antelación para intentar mantener los portaobjetos y las muestras en orden antes de llenar los pocillos. Las mordazas se etiquetan fácilmente después de ser colocadas sobre el pocillo. Si las mordazas están completamente refrigeradas, los bloques se pueden retirar del pocillo en unos 15 segundos antes de que se complete la congelación. El proceso de congelación se completa en cualquier superficie de congelación mientras se preparan bloques adicionales. En el tiempo que se tarda en llenar los cuatro pocillos, los primeros pocillos llenos se pueden retirar y se pueden colocar más muestras en los pocillos vacíos. Cuando el profesional esté listo para cortar los bloques, se congelarán por completo. Se pueden congelar ocho bloques en menos de dos minutos.

Retirada del bloque

Un golpe fuerte en el vástago de la mordaza usando el bloque de congelación libera fácilmente los bloques. El golpe fuerte provoca una escisión en el plano de cohesión que se forma entre el acero frío y el medio congelado. Si uno intenta extraer el bloque por el vástago, lo encontrará firmemente unido en los pocillos más grandes, pero un golpe fuerte liberará el bloque con facilidad.

Los bloques se liberarán y quedarán intactos incluso si están incompletamente congelados, siempre que la superficie debajo de la mordaza haya tenido tiempo de congelarse y unirse a esta.

Si una mordaza se desprende, este es el resultado de un llenado insuficiente del pocillo con el medio o del uso de una mordaza caliente sin el bloque de congelación. Esto se puede arreglar de forma rápida y sencilla mediante la adición de una capa adicional de medio de inclusión y una nueva mordaza.

Enlucido

La técnica de enlucido se utiliza para reparar cualquier orificio, defecto o hendidura que se encuentre en la cara de un bloque preparado con este sistema o métodos convencionales (Figura 7). En ocasiones, puede formarse un pequeño espacio de contracción en la superficie del bloque entre el medio que recubrió el tejido y el medio que llenó el pocillo. Este espacio es muy superficial y se recortará rápidamente en la primera preparación de la superficie del bloque. En muestras minúsculas en las que solo se permiten recortes mínimos, el proceso de enlucido rellenará cualquier defecto en unos segundos. El llenado de los orificios causados por las burbujas en el medio de inclusión o el defecto surgido después de retirar una grapa no deseada del bloque mejorará la capacidad de obtener una sección completa. La Figura 7A muestra un ejemplo de irregularidades en la superficie que pueden observarse en el lecho criogénico de bloques congelados rellenados rápidamente con enlucido. La técnica de enlucido se realiza de la siguiente manera:

  1. Aplique una gota de medio de inclusión a cualquier defecto importante en la cara del bloque (Figura 7B).
  2. Presione la cara del bloque contra una superficie de congelación (Figura 7C)
  3. Suéltelo con un golpecito o tire (Figura 7D).

El medio se puede aplicar como una gota del frasco, un fino frotis con el dedo, un borde recto de cartón o cualquier dispositivo que actúe como espátula de masilla. Si ha comenzado el recorte, este proceso puede realizarse mientras el bloque está en el soporte aplicando medio a la cara del bloque y, a continuación, presionando el bloque de congelación contra la cara del bloque de tejido. Esta técnica puede utilizarse para aplicar "algo de medio de inclusión" al borde del bloque si una parte crítica del tejido está demasiado cerca del borde como para obtener una sección de calidad.

Orientación del tejido hacia la cuchilla

Este es un aspecto extremadamente importante de la preparación de cortes congelados. Mediante el uso del sistema de inclusión descrito en este artículo, es bastante fácil preparar y orientar los tejidos en los pocillos para que la cuchilla entre en contacto con el tejido en una orientación específica. Con base en la amplia experiencia, se aplican las siguientes reglas generales:

  1. La grasa debe ser lo último que toque la cuchilla o debe tocarla por sí sola cuando sea posible (Figura 8A y B). La grasa no se vuelve lo suficientemente dura como para cortarse bien a las temperaturas que son ideales para cortar la mayoría de los demás tejidos. Cuando la grasa toca la cuchilla antes que los tejidos más manejables, puede manchar y estropear el resto de la sección. Creo que, al hacer que la grasa sea lo último en tocar la cuchilla o que lo haga por sí sola, la interferencia con otros tejidos es mínima. Si tengo dificultades para conseguir una buena sección porque aparece grasa en el plano, giro el plato de garras para evitar la grasa.
  2. El borde más crítico del tejido debe ser perpendicular o diagonal a la cuchilla y no la primera o última parte del tejido que toque la cuchilla. Consideremos que una sección tiene un principio, un centro y un final. Al principio, existe el riesgo de que se produzca un rizado o daños provocados por el cepillo y posiblemente problemas de grosor debido a la vacilación al abordar el tejido. Estas son oportunidades para los artefactos. Del mismo modo, en el final, el rizado puede convertirse en un problema y posiblemente estirarse al recoger el tejido. El centro es la zona en la que el tejido pasa más suavemente a través de la cuchilla. Ahí es donde hay menos probabilidades de ver artefactos y se obtiene la histología más limpia. Aquí es donde quiero ver esa parte crítica del portaobjetos, como un margen teñido.
  3. Los tejidos epiteliales y mucosos revestidos, como la piel y los tejidos gastrointestinales, vesicales, uterinos y cervicouterinos, deben orientarse con el plano del epitelio perpendicular a la cuchilla. Al incluir una elipse de piel, el extremo que primero toca la hoja tiene tendencia a rizarse. El diagrama de la Figura 9 muestra un enfoque para incluir una elipse pequeña de piel, de modo que los márgenes longitudinales (2-5) sean los últimos en tocarla.

Estoy seguro de que hay muchas otras ideas y sugerencias sobre este tema. Todos aprendemos mucho sobre ello durante nuestra carrera. La cuestión es pensar en cómo el producto final es resultado de cómo el tejido entra en contacto con la cuchilla. Este sistema ofrece la capacidad de organizar el tejido como usted desee.

Discusión

Este sistema de inclusión boca abajo de tejidos reproduce todas las ventajas de la inclusión boca abajo, como en la inclusión en parafina utilizada en la histología rutinaria. La propiedad del tejido para adherirse inmediatamente al acero frío hace que este proceso sea aún más fácil que la inclusión en parafina en muchos aspectos. El sistema proporciona ventajas distintivas sobre los métodos disponibles para la inclusión de tejido para secciones congeladas, como velocidad, precisión, reducción del desperdicio de tejido, facilidad de aprendizaje y comodidad.

La velocidad a la que se realiza el corte congelado mejora en varios niveles. La preparación de bloques individuales es considerablemente más rápida que cuando se utiliza la disposición típica de extractor de calor de barra de congelación que se ofrece en los criostatos actuales. Con este aparato, los bloques se congelan en tan solo 20 segundos en pocillos pequeños y en minutos en los pocillos más grandes. Este sistema mejora la velocidad de preparación al permitir la preparación rápida de múltiples bloques. Una vez llenos los pocillos, no es necesario controlar el proceso de congelación en el momento en que se deba colocar el extractor de calor. Cuando se uno se enfrenta a varias muestras a la vez de diferentes quirófanos, la posibilidad de poder dejar el criostato para realizar otras tareas mientras los bloques se congelan ahorra un tiempo valioso. La velocidad también se ve mejorada por la necesidad de menos bloques. El pocillo grande de 30 mm permite ver secciones de tejido panorámicas o colocar varias muestras en un solo pocillo. Otra ventaja es que todos los bloques están preparados para ser planos, de espesor similar, con las caras de las mordazas aproximadamente paralelas a la cara del tejido. Esto conduce a un menor recorte de los bloques y una menor necesidad de ajustar el ángulo del portamuestras para obtener la sección deseada sin desperdiciar tejido en el recorte.

La característica principal de este sistema es la capacidad de proporcionar una cara de tejido incluido plana altamente predecible, lo que mejora la capacidad de proporcionar un diagnóstico preciso. Como se ha comentado anteriormente, este sistema permite al operador orientar la muestra con precisión con la superficie tisular deseada en un plano horizontal. La inclusión boca abajo se ha utilizado en el pasado en forma de moldes de plástico. Este sistema tiene una clara ventaja sobre los moldes de plástico: aprovecha la propiedad física del tejido para adherirse al metal a temperatura de congelación. El tejido se coloca fácilmente en cualquier posición adhiriéndose al suelo del pocillo. Los pétalos de flor de la Figura 10 se colocan simplemente en una gota de medio de inclusión y se posicionan en el borde. Esto puede lograrse con la misma facilidad utilizando una parte membranosa del tejido o para mantener un cabello en posición vertical para ese fin. Se pueden orientar varias piezas con precisión en cualquier dirección para que el tejido pueda entrar en contacto con la cuchilla en el ángulo deseado, lo que permite una sección de la mejor calidad.

Este sistema también evita los artefactos de aplastamiento resultantes de los pesos del extractor de calor que aplanan la superficie tisular, como sucede con los criostatos convencionales.

La cantidad de recorte necesaria para obtener una sección completa se reduce en gran medida como resultado de la cara de tejido plano. La capacidad del sistema para colocar la superficie tisular deseada en un plano horizontal reduce la necesidad de cortar más profundamente para obtener un área específica, una epidermis completa o un margen completo. La Figura 11 muestra un bloque con 51 semillas de amapola recortadas en un solo plano. Si se considera una analogía de recibir 51 diminutas biopsias cerebrales del tamaño de una semilla de amapola, ¿cuál es la probabilidad de que las 51 se puedan visualizar en una sección congelada usando métodos convencionales? Y, ¿cuántas se dejarían para secciones permanentes? El resultado de esta inclusión precisa y plana es la capacidad de conservar una muestra para secciones permanentes, también conocida como control de secciones congeladas.

Este sistema se puede enseñar y aprender fácilmente. Con una experiencia mínima, los residentes y los técnicos pueden preparar muestras que no pueden conseguirse con métodos convencionales. Aquellos patólogos que sepan que es un residente con menos experiencia quien está preparando sus portaobjetos pueden estar tranquilos con la calidad de la preparación que este sistema puede ofrecer. También es un sistema muy cómodo para que el patólogo incluya la muestra de forma rápida y fiable para que el residente o el técnico la corten. Saber que la superficie que se coloca hacia abajo es la superficie que el técnico verá cuando emerja el bloque.

La colocación de un estante de inclusión bajo la abertura frontal del criostato maximiza la comodidad y destreza disponibles en el proceso de inclusión.

El sistema utiliza aparatos que funcionan simplemente manteniendo frío el criostato. El aparato está fabricado en acero inoxidable, lo que garantiza una vida útil de servicio en cualquier condición. Las únicas piezas potencialmente consumibles son los portaobjetos de dispensación de vinilo, que son muy económicos. Aparte del medio de inclusión, no hay necesidad de consumibles caros como el nitrógeno líquido. Si se va a instalar un estante de inclusión, este simplemente requiere la colocación de dos tornillos en la pared frontal del criostato, una tarea que puede realizar sin problemas el personal de mantenimiento del hospital o los técnicos del criostato.

El único mantenimiento necesario es la limpieza ocasional del pocillo con una gasa humedecida con alcohol. Es raro ver que en los pocillos quede algo que no sea escarcha. En ocasiones, en casos en los que se colocan en el pocillo tejidos necróticos desmenuzados o líquidos sanguinolentos, puede observarse un pequeño residuo. En general, la capa de medio de inclusión colocada en el portaobjetos dispensador crea un plano limpio de escisión. Cualquier residuo microscópico que pueda pasar desapercibido y pueda adherirse al siguiente bloque nuevo se recortará en el recorte de superficie inicial de ese bloque.

Conclusión

Este sistema para la inclusión de muestras de tejido para secciones congeladas utiliza la inclusión boca abajo en pocillos de temperatura de congelación y ofrece ventajas dramáticas en cuanto a precisión, velocidad, disminución del desperdicio de tejido, facilidad y comodidad. El sistema se puede adaptar fácilmente a criostatos existentes de todas las variedades. El sistema requiere un aparato simple y una vez instalado solo requiere una limpieza simple como mantenimiento.

Figuras

Figura 1. Aparato. (A) Barra del pocillo de inclusión: De arriba a abajo pocillos de 30 mm; pocillos de 24 mm y pocillos de 18 mm. (B) Mordazas. El acero inoxidable en tamaños de 36 y 28 mm está diseñado para usarse en frío para una congelación rápida con canales profundos para un agarre fuerte en el bloque. El patrón de canal de cruce permite la extrusión del medio de inclusión sobrante al colocar la mordaza. (C) Bloque de congelación sobre la mordaza. Este bloque se coloca sobre el vástago de la mordaza para funcionar como un extractor de calor, lo que permite utilizar mordazas calientes o frías. (D) Portaobjetos de dispensación. Estos portaobjetos de vinilo se utilizan para colocar tejido en el pocillo de inclusión en una posición y orientación precisas. (E) Estante de inclusión. Este estante de acero extraíble proporciona una zona de trabajo cómoda y ergonómica para el proceso de inclusión.
Figura 1. Aparato. (A) Barra del pocillo de inclusión: De arriba a abajo pocillos de 30 mm; pocillos de 24 mm y pocillos de 18 mm. (B) Mordazas. El acero inoxidable en tamaños de 36 y 28 mm está diseñado para utilizarse en frío para una congelaci
Figura 2. Técnica de inclusión boca abajo. (A) Medio de inclusión aplicado en una fina capa en el portaobjetos de dispensación. (B) El tejido se coloca en el extremo del portaobjetos dispensador hacia abajo en posición y con la orientación precisa; tres tiras de piel pigmentada oscuramente tintada solo en la parte central (no en los bordes); aproximadamente 15 mm de longitud x 1,5 mm de ancho x 1,5 mm de profundidad. (C) El portaobjetos se gira para ver la cara que se va a incluir. El tejido puede manipularse aún más en una posición precisa prestando atención a los detalles deseados en la cara del bloque incluido. (D) Se tira ligeramente del tejido sobre el borde del portaobjetos y se hace tocar con el suelo del pocillo, donde se adhiere al acero a temperatura de congelación. Entonces, el portaobjetos dispensador se extrae de debajo del tejido adherente. Las muestras que requieren una colocación precisa pueden aplanarse o manipularse y ajustarse a la posición deseada realizando este paso lenta y cuidadosamente. (E) Pocillo llenado. Un menisco de protuberancias medianas por encima del nivel de la superficie de la barra del pocillo. (F) La mordaza se coloca sobre el pocillo plana respecto a la superficie de la barra. El exceso de medio se extruye a través de los canales de la mordaza. (G) El bloque de congelación sobre la mordaza se coloca sobre el vástago de esta. (H) Extracción del bloque. Usando el bloque de congelación sobre la mordaza, el bloque se quita con un golpe fuerte en el vástago de esta. (I) El bloque terminado antes del recorte muestra una superficie plana completamente visible con el margen profundo y la epidermis tintados completamente expuestos y con una necesidad menor de recorte. (J) Bloque recortado. Epidermis y tinta totalmente expuestas. (K) Fotografía de un portaobjetos con secciones congeladas. Sección completa de las tres piezas. (L) Fotomicrografía de la piel que muestra una epidermis bien orientada y un margen profundo teñido (aumento de 50x).
Figura 2. Técnica de inclusión boca abajo. (A) Medio de inclusión aplicado en una fina capa en el portaobjetos de dispensación. (B) El tejido se coloca al final del portaobjetos de dispensación boca abajo en la posición y orientación precisas; tres
Figura 3. Molinete (A) La parte superior izquierda muestra semillas de sésamo teñidas colocadas en una orientación específica en el suelo de un pocillo de 30 mm. (B) La parte inferior izquierda muestra la cara del bloque retirada del pocillo antes del recorte. (C) La parte derecha muestra la cara del bloque recortado.
Figura 3. Molinete (A) La parte superior izquierda muestra semillas de sésamo teñidas colocadas en una orientación específica en el suelo de un pocillo de 30 mm. (B) La parte inferior izquierda muestra la cara del bloque retirada del pocillo antes de
Figura 4. Con ayuda del portaobjetos dispensador, se colocan fácilmente cuatro porciones de tejido de aproximadamente 1,0 cm en el pocillo de 30 mm. Observe que, aunque estas porciones de tejido varían mucho en grosor, se incluirán en un plano horizontal y requerirán un recorte mínimo.
Figura 4. Con ayuda del portaobjetos dispensador, se colocan fácilmente cuatro porciones de tejido de aproximadamente 1,0 cm en el pocillo de 30 mm. Observe que, aunque estas porciones de tejido varían mucho en grosor, se incluirán en un plano horizo
Figura 5. Las muestras líquidas se incluyen fácilmente en estos pocillos sin ser aplastadas por un extractor de calor. (A) Tejidos líquidos colocados en el pocillo con una cuchara. (B) El líquido incluido forma un bloque tridimensional que se puede cortar para realizar secciones congeladas, a la vez que conserva el tejido para secciones permanentes. La muestra se prepara con el medio de inclusión.
Figura 5. Las muestras líquidas se incluyen fácilmente en estos pocillos sin ser aplastadas por un extractor de calor. (A) Tejidos líquidos colocados en el pocillo con una cuchara. (B) El líquido incluido forma un bloque tridimensional que se puede co
Figura 6. Líquidos. Una muestra artística que demuestra la facilidad de la inclusión de líquidos, no solo en un bloque tridimensional, sino también en una orientación específica. Líquidos preparados a partir de medio de inclusión teñido con colorante alimentario.
Figura 6. Líquidos. Una muestra artística que demuestra la facilidad de la inclusión de líquidos, no solo en un bloque tridimensional, sino también en una orientación específica. Líquidos preparados a partir de medio de inclusión teñido con colo
Figura 7. Enlucido. (A) Cara de bloque preparada por crioinclinación de bloque congelado que muestra irregularidades de superficie. (B) Se aplica una pequeña gota de medio de inclusión a la cara del bloque. (C) La cara del bloque se presiona inmediatamente contra una superficie de congelación. (D) El bloque se saca de la superficie de congelación para demostrar una fina capa de medio de inclusión que recubre la superficie y rellena cualquier defecto.
Figura 7. Enlucido. (A) Cara de bloque preparada por crioinclinación de bloque congelado que muestra irregularidades de superficie. (8) Se aplica una pequeña gota de medio de inclusión a la cara del bloque. (C) La cara del bloque se presiona inmediatam
Figura 8. Orientación del tejido graso que contiene el tejido hacia la cuchilla. (A) Un bloque recortado que muestra un tumor de mama con el margen graso tintado orientado perpendicular a la cuchilla. El tejido graso se corta sin interferir con el tejido tumoral y el margen se conserva mejor en esta sección vertical. (B) Primer plano del corte del portaobjetos del bloque en 2(A) que muestra una sección adecuada que contiene el tejido graso y un margen de resección claramente visible a la izquierda.
Figura 8. Orientación del tejido graso que contiene el tejido hacia la cuchilla. (A) Un bloque recortado que muestra un tumor de mama con el margen graso tintado orientado perpendicular a la cuchilla. El tejido graso se corta sin interferir con el tejido
Figura 9. Orientación de la piel hacia la cuchilla. El diagrama muestra un enfoque para incluir una elipse pequeña de piel, de modo que la epidermis esté perpendicular a la hoja y los márgenes longitudinales (2-5) sean los últimos en tocarla.
Figura 9. Orientación de la piel hacia la cuchilla. El diagrama muestra un enfoque para incluir una elipse pequeña de piel, de modo que la epidermis esté perpendicular a la hoja y los márgenes longitudinales (2-5) sean los últimos en tocarla.
Figura 10. Pétalos en el borde. Un bloque de corte congelado recortado que muestra una representación de naturaleza muerta creada mediante la inclusión de pétalos de flores y hojas en el borde.
Figura 10. Pétalos en el borde. Un bloque de corte congelado recortado que muestra una representación de naturaleza muerta creada mediante la inclusión de pétalos de flores y hojas en el borde.
Figura 11. Caracol de semillas de amapola. Bloque recortado de 51 semillas de amapola incluidas en una espiral. En una situación análoga utilizando 51 muestras de tejido minúsculas, se podría obtener una sección congelada a este nivel, conservando las 51 muestras para la sección permanente.
Figura 11. Caracol de semillas de amapola. Bloque recortado de 51 semillas de amapola incluidas en una espiral. En una situación análoga utilizando 51 muestras de tejido minúsculas, se podría obtener una sección congelada a este nivel, conservando la
 

Reconocimientos

El autor desea agradecer a los siguientes educadores por el tiempo y conocimientos dedicados a ayudar a preparar este artículo: Zoe Ann Durkin. Med. HT. Hartford Hospital: Sandra King. BS, HT. Darton College University System of Georgia: Pamela Colony. PhD. HT, SUNY College of Agriculture & Technology; Hazel Dalton, BA, HT. U of Texas. MD Anderson Cancer Ctr.: Paula Bober. HT DMC. University Labs-Harper University Hospital. También me gustaría agradecer a Barbara Stripoli por educarme en el arte de la sección de congelación en Mohs Surgery y a Michael Mac Dougall de Belair Instrument Company por su apoyo y asesoramiento técnico.

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