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Una introducción a la tinción rutinaria y especial

La tinción de rutina con H&E y las tinciones especiales desempeñan un papel fundamental en el diagnóstico o la investigación basados en tejidos. Al colorear secciones de tejido transparentes, estas tinciones permiten a patólogos e investigadores altamente cualificados ver, bajo un microscopio, la morfología del tejido (estructura) o buscar la presencia o prevalencia de tipos de células particulares, estructuras o incluso microorganismos como bacterias.

En el laboratorio de histopatología, el término “tinción rutinaria” se refiere a la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) que se utiliza “de forma rutinaria” con todas las muestras de tejido para revelar las estructuras y condiciones tisulares subyacentes. El término “tinciones especiales” se ha utilizado durante mucho tiempo para hacer referencia a un gran número de técnicas de tinción alternativas que se utilizan cuando la técnica con H&E no proporciona toda la información que el patólogo o investigador necesita.

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Por qué la tinción con H&E es rutinaria

La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) se utiliza de forma rutinaria en laboratorios de histopatología, ya que proporciona al patólogo/investigador una vista muy detallada del tejido. Esto se consigue mediante la tinción clara de estructuras celulares, incluido el citoplasma, el núcleo y los orgánulos y los componentes extracelulares. Esta información es a menudo suficiente para permitir un diagnóstico de enfermedad basado en la organización (o desorganización) de las células y también muestra cualquier anomalía o indicador particular en las células reales (como los cambios nucleares que normalmente se observan en el cáncer). Incluso cuando se utilizan métodos de tinción avanzados, la tinción H&E sigue formando una parte crítica del panorama diagnóstico, ya que muestra la morfología tisular subyacente que permite al patólogo/investigador interpretar correctamente la tinción avanzada.

En un laboratorio de histología clínica, todas las muestras se tiñen inicialmente con H&E y las tinciones especiales o avanzadas solo se solicitan si se necesita información adicional para proporcionar un análisis más detallado, por ejemplo, para diferenciar entre dos tipos de cáncer morfológicamente similares.

Debido al volumen de tinción de H&E necesario, la mayoría de los laboratorios clínicos utilizan sistemas totalmente automatizados y la tinción manual es hoy en día poco frecuente.

Figura 2: Esta sección de la mucosa del intestino delgado muestra heterocromatina y nucléolos bien definidos en las células epiteliales y en las células plasmáticas de la lámina propia
Esta sección de la mucosa del intestino delgado muestra heterocromatina y nucléolos bien definidos en las células epiteliales y en las células plasmáticas de la lámina propia
Figura 3: Las figuras mitóticas se tiñen nítidamente dentro del epitelio glandular en una sección del intestino delgado
Las figuras mitóticas se tiñen nítidamente dentro del epitelio glandular en una sección del intestino delgado
Figura 4: En este campo de la lámina propia del intestino delgado, el citoplasma de las células plasmáticas se ha teñido con hematoxilina, excepto el área perinuclear pálida, que se corresponde con un aparato Golgi bien desarrollado
En este campo de la lámina propia del intestino delgado, el citoplasma de las células plasmáticas se ha teñido con hematoxilina, excepto el área perinuclear pálida, que se corresponde con un aparato Golgi bien desarrollado
Figura 5: Este ganglio autónomo del plexo mientérico, situado entre las capas musculares lisas de la muscularis externa del intestino delgado, contiene neuronas ganglionares que muestran una sustancia basófila de Nissl bien definida (agregaciones de retículo endoplasmático y ARN ribosómico) en su citoplasma.
Este ganglio autónomo del plexo mientérico, situado entre las capas musculares lisas de la muscularis externa del intestino delgado, contiene neuronas ganglionares que muestran una sustancia basófila de Nissl bien definida (agregaciones de retículo en

Química de la H&E

La tinción H&E utiliza dos colorantes: hematoxilina y eosina. Esta combinación se utiliza debido a que cada uno de estos colorantes tiñe diferentes elementos tisulares.

La hematoxilina reacciona como un tinte básico con un color azul púrpura. Tiñe la estructura ácida o basófila, incluido el núcleo celular (que contiene ADN y nucleoproteína) y los orgánulos que contienen ARN como los ribosomas y el retículo endoplásmático rugoso.

La eosina es un colorante ácido que normalmente da un color rojizo o rosa. Tiñe estructuras básicas, o acidófilas, que incluyen el citoplasma, las paredes celulares y las fibras extracelulares.

Fuentes de los colorantes

La hematoxilina se extrae de un árbol llamado palo de Campeche y se purifica. Luego se oxida y se combina con un mordiente (normalmente aluminio) para permitir que se una a las estructuras celulares. De las muchas preparaciones de hematoxilina utilizadas en la histología, la hematoxilina de Gill, la hematoxilina de Harris y la hematoxilina de Mayer son las más populares.

La eosina se forma por una reacción entre el bromo y la fluoresceína. Hay dos variantes de eosina que se utilizan habitualmente en histología: la eosina Y, que es ligeramente amarillenta, y la eosina B, que es ligeramente azulada. La eosina Y es la más popular.

Figura 6: Estructura química de la hematoxilina
Estructura química de la hematoxilina
Figura 7: Estructura química de la eosina Y
Estructura química de la eosina Y

Special Stains

The term special stains traditionally referred to any staining other than an H&E. It covers a wide variety of methods that may be used to visualize particular tissue structures, elements, or even microorganisms not identified by H&E staining.

Other methods of staining use immunohistochemistry or in situ hybridization to target specific proteins or DNA/RNA sequences. These methods were sometimes also included as members of the “special stains” family. However they are quite different in method and purpose and are now typically separated into a third category know as “advanced stains”.

While there are literally hundreds of special stains for all manner of purposes, only a few are used with any regularity in clinical histology. The variety of stains also means that special staining is not as automated as H&E staining. While many larger laboratories do use automated instruments for the more common stains, they still have an area for hand staining. The complexity of some stains also works against the uses of automation.

Algunas tinciones especiales comunes

Las imágenes siguientes ilustran algunas de las tinciones especiales comunes y sus aplicaciones.

Figura 8: Tinción tricrómica de Masson (piel). Esta tinción está indicada en la observación histológica de fibras de tejido conjuntivo de colágeno en muestras de tejido. Se utiliza para ayudar a diferenciar el colágeno y el músculo liso en los tumores y a detectar enfermedades o cambios en el tejido conjuntivo/muscular.
El kit de tinción tricrómica de Masson está indicado en la observación histológica de fibras de tejido conjuntivo de colágeno en muestras de tejido. Se utiliza para ayudar a diferenciar el colágeno y el músculo liso en los tumores y a detectar enf
Figura 9: Tinción argéntica GMS modificada (izquierda: Pneumocystis, pulmón) (derecha: infección por Aspergillus, pulmón). La finalidad de uso de la tinción argéntica GMS modificada es la observación histológica de hongos, la membrana basal y algunos organismos oportunistas tales como el Pneumocystis carinii en muestras de tejido.
La finalidad de uso del Kit de tinción argéntica GMS modificada es la observación histológica de hongos, la membrana basal y algunos organismos oportunistas tales como el Pneumocystis carinii en muestras de tejido.
Figura 10: Ácido peryódico de Schiff (riñón). La tinción PAS se utiliza principalmente para el teñido de estructuras que contienen una alta proporción de carbohidratos tales como el glucógeno, las glucoproteínas, proteoglucanos que normalmente se encuentran en los tejidos conjuntivos, mucosas y membranas basales. A menudo se utiliza para teñir biopsias renales, hepáticas ciertas tesaurismosis del glucógeno en músculos estriados y presuntas infecciones micóticas.
La tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) se utiliza principalmente para el teñido de estructuras que contienen una alta proporción de carbohidratos tales como el glucógeno, las glucoproteínas, proteoglucanos que normalmente se encuentran en l
Figura 11: Hierro con azul Prusia de Perls (hígado). Este colorante se utiliza para detectar e identificar el ión férrico (Fe3+) en preparaciones de tejidos, frotis de sangre o frotis de médula ósea. Habitualmente se encuentran cantidades minúsculas de hierro férrico (hemosiderina) en la médula ósea y el bazo. Las cantidades anómalas de hierro pueden indicar hemocromatosis y hemosiderosis.
Las tinciones de hierro con azul Prusia de Perl se utilizan para detectar e identificar el ión férrico (Fe3+) en preparaciones de tejidos, frotis de sangre o frotis de médula ósea. Habitualmente se encuentran cantidades minúsculas de ácido férrico
Figura 12: Ziehl Neelsen (bacilo acidorresistente, pulmón). Esta tinción se utiliza para detectar e identificar bacilos acidorresistentes en el tejido. Los bacilos son organismos bacterianos con forma de varilla. Una función principal de esta tinción es identificar la tuberculosis en el tejido pulmonar.
Los colorantes para bacilos acidorresistentes se emplean para detectar e identificar bacilos acidorresistentes en los tejidos. Los bacilos son organismos bacterianos con forma de varilla. Una función principal de este colorante es identificar la tubercul
Figura 13: Azul alcián (intestino). El azul alcián se prepara normalmente en un pH de 2.5 y se emplea para identificar mucopolisacáridos ácidos y mucinas ácidas. Las cantidades excesivas de mucosustancias ácidas no sulfatadas se observan en los mesoteliomas, ciertas cantidades aparecen normalmente en los vasos sanguíneos pero aumentan en lesiones precoces de ateroesclerosis.
El azul alcián se prepara normalmente en un pH ácido de 2,5 y se emplea para identificar mucopolisacáridos ácidos y mucinas acéticas. Las cantidades excesivas de mucosustancias ácidas no sulfatadas se observan en los mesoteliomas, ciertas cantidades
Figura 14: Azul alcián y PAS (intestino). Una tinción que combina las propiedades de la tinción con azul alcián y con ácido peryódico de Schiff.
El azul alcián y el PAS combinan las propiedades de la tinción con azul alcián y con ácido peryódico de Schiff.
Figura 15: Tricrómico de Gomori (azul) (submucosa). Las tinciones tricrómicas se utilizan para teñir e identificar fibras musculares, colágeno y núcleos. Pueden usarse para el contraste de músculo esquelético, cardíaco o liso. El tricrómico de Gomori es una simplificación de la tinción tricrómica de Masson más elaborada y combina la tinción de plasma (con cromotropo 2R) y tejido conjuntivo para ofrecer una imagen de contraste brillante.
El tricrómico de Gomori azul se utiliza para teñir e identificar fibras musculares, colágeno y núcleos. Pueden usarse para el contraste de músculo esquelético, cardíaco o liso. El tricrómico de Gomori es una simplificación de las tinciones más e
Figura 16: Tricrómico de Gomori (verde) (submucosa). Las tinciones tricrómicas se utilizan para teñir e identificar fibras musculares, colágeno y núcleos. Pueden usarse para el contraste de músculo esquelético, cardíaco o liso. El tricrómico de Gomori es una simplificación de la tinción Masson más elaborada y combina la tinción de plasma (con cromotropo 2R) con la tinción de tejido conjuntivo para ofrecer una imagen de contraste brillante.
El tricrómico de Gomori verde se utiliza para teñir e identificar fibras musculares, colágeno y núcleos. Pueden usarse para el contraste de músculo esquelético, cardíaco o liso. El tricrómico de Gomori es una simplificación de las tinciones más
 

Pasos para obtener mejores tinciones especiales

En Leica Biosystems, nuestra visión es avanzar en el diagnóstico del cáncer y mejorar la vida de las personas. Una forma de lograr esta visión es ayudando a mejorar la calidad de la tinción. Puesto que reconocemos que la calidad de la IHC y la ISH no comienza en la estación de tinción, esta serie examina muchos aspectos diferentes de la calidad de la tinción y analiza cómo influirán las pruebas futuras en un mejor diagnóstico.

Comprender la tinción

Sepa qué está intentando demostrar con la tinción que está realizando.

El simple hecho de “seguir el método” y no saber realmente lo que se debe ver en la sección terminada dará lugar a malos resultados.

Sección de hígado teñida con PAS. La lipofuscina y el glucógeno son positivos para PAS, mientras que los restos de bilis y hemosiderina son negativos para PAS y aparecen con sus colores naturales (amarillo y marrón, respectivamente). B. Esta sección muestra una infección micótica oportunista en el pulmón (Aspergillus) teñida con el método de Grocott-Gomori. Las hifas micóticas son negras, al igual que el carbono sin tinción, una característica común en los pulmones de los fumadores y la mayoría de los habitantes de ciudades.
Comprender la tinción

Usar un control positivo

Utilice siempre una preparación de control que contenga la estructura/sustancia que está intentando demostrar.

“Si la estructura/sustancia para la que estamos tiñendo no es visible en una preparación, suponemos que no está presente”.

A. Sección de hígado cirrótico teñida con el método de Perl para demostrar hemosiderina con hierro (azul). Esto constituiría un bloque de control satisfactorio para las tinciones de hierro.
Usar un control positivo

Usar un tiempo preciso

 Use un tiempo preciso.

El tiempo siempre es aproximado. Una temporización imprecisa produce resultados incoherentes.

Estas dos secciones de piel del mismo bloque se han teñido con el método PAS. La sección A se trató con ácido peryódico (paso de oxidación) durante 5 minutos, mientras que la sección B solo estuvo 30 segundos (un error). Observe que la membrana basal está muy mal teñida en la sección B como consecuencia.
Usar un tiempo preciso

Considerar la estabilidad de los reactivos

Tenga en cuenta la vida útil de los reactivos que está utilizando. Algunos reactivos o soluciones de tinte se deterioran lentamente, mientras que otros son muy inestables y deben prepararse frescos y utilizarse inmediatamente. Hay que dejar que otros se oxiden (maduren) durante algún tiempo antes de poder usarlos.

Asumimos que todos los reactivos pueden utilizarse durante un periodo indefinido.

Hematoxilina de Weigert turbia debido a la oxidación excesiva. Observe la tinción marrón del colágeno.
Considerar la estabilidad de los reactivos

Almacenar los reactivos correctamente

Almacenar los reactivos correctamente. Algunos requieren refrigeración porque tienden a soportar el crecimiento de hongos o moho. Otros son sensibles a la luz y requieren un almacenamiento en la oscuridad.

 “Todos nuestros reactivos se almacenan en el estante situado encima del banco de tinción. A veces vemos organismos extraviados en nuestras secciones”.

Esta sección muestra grandes depósitos de microorganismos ajenos que han crecido en la solución de tinción (en este caso, hematoxilina) y, a continuación, se han depositado en la parte superior de la sección.
Almacenar los reactivos correctamente

Respetar el método

Siga exactamente el protocolo.

Los miembros del personal obtienen diferentes resultados aunque usen supuestamente el mismo protocolo.

Estas secciones de submucosa fijada en formol se han teñido con la tinción tricrómica de Masson. La sección A muestra el músculo liso rojo. En este caso, la tinción se realizó correctamente siguiendo el protocolo del laboratorio e incluyendo un paso de ácido crómico preliminar (sensibilización o mordiente secundario). Este paso se pasó por alto cuando se tiñó la sección B. Observe la falta de coloración diferencial del músculo en la sección B (intestino).
Respetar el método

Registrar cualquier cambio

Documente cualquier desviación del método que esté utilizando.

A veces, cuando los resultados son malos, es difícil o imposible averiguar por qué no se han registrado los cambios en el protocolo.

En esta tinción de impregnación argéntica para reticulina, las fibras no están bien demostradas y hay espuma de fondo (precipitado) en la preparación. Es muy difícil determinar la causa de dicho problema si el método no se ha seguido exactamente (método de Gordon & Sweets, riñón).
Registrar cualquier cambio

Estandarizar los pasos de lavado

Tenga especial cuidado con los pasos de lavado. Estandarícelos tanto como sea posible, ya que son con frecuencia la causa de resultados variables.

Los miembros del personal del laboratorio utilizan diferentes técnicas de lavado: algunos utilizan una agitación enérgica, otros son mucho más suaves.

Estas secciones de hígado se tiñeron con el mismo método. La única diferencia entre ellas fue la técnica mediante la cual se enjuagaron entre la impregnación y la reducción. Las fibras de reticulina son negras y están mejor definidas en la sección A (método de Gordon & Sweets).
Estandarizar los pasos de lavado

Preparar el microscopio cuidadosamente

Utilice el control microscópico en etapas cruciales, como los pasos de diferenciación. Tenga en cuenta el efecto de la configuración del microscopio sobre el aspecto de las secciones sin cubreobjetos (húmedas); puede producir el aspecto de una tinción de fondo falsa.

Para todos los métodos, el nivel de tinción se evalúa mirando la preparación a simple vista.

 

 

A: Sección húmeda (sin cubreobjetos) vista bajo un microscopio con diafragma del condensador cerrado. Observe el fondo falso. B: Sección húmeda (sin cubreobjetos) vista bajo un microscopio con diafragma del condensador abierto. Observe el fondo claro.
Preparar el microscopio cuidadosamente

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