Studie zur Leistungsfähigkeit verschiedener Deckgläser in der Mikroskopie

1. Einleitung

Gegenstand dieses Projekts ist eine vergleichende Studie zum Einfluss verschiedener Abdeckmedien auf die Bildgebung in mikroskopischen Anwendungen. Konkret umfasst sie einen Vergleich zwischen herkömmlichen Deckgläsern (Leica HistoCore SPECTRA CV) und Polymerfolien (Sakura Tissue-Tek). Die bereitgestellten Proben wurden automatisch auf einem Leica- und einem Sakura Tissue-Tek-Eindeckautomaten vorbereitet.

Deckglas und Eindeckmedium bilden praktisch die Frontoptik jedes biomedizinischen Mikroskops. Da alle aktuellen Mikroskopobjektive eine beugungsbegrenzte Auflösung aufweisen, beeinflussen bereits geringe Abweichungen in den optischen Eigenschaften dieser Komponenten die Leistung der Mikroskopoptik. Daher muss das optische Design dieser Objektive die optischen Eigenschaften der Abdeckmedien berücksichtigen.

Die wichtigsten zu berücksichtigenden Parameter sind Brechungsindex, absolute Dicke und Oberflächenplanität. Diese sind hauptsächlich für Beeinträchtigungen der Qualität des mikroskopischen Bildes verantwortlich. Darüber hinaus können induzierte Formabweichungen des Deckmediums, die auftreten, wenn sich die Abdeckfolie an die darunterliegende Probe anpasst, optische Aberrationen im Strahlengang verursachen.

Dieser Bericht fasst die wichtigsten Ergebnisse der Messungen und Simulationen zusammen.

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2. Messung der optischen Eigenschaften des Abdeckmediums

2.1 Oberflächenprofilmessungen

Zur Charakterisierung der Oberflächentopografie und Rauheit der Abdeckmedien wurden zwei verschiedene Methoden angewendet: taktile Profilometrie und Weißlichtinterferometrie:

1. Taktile Profilometrie: Diese Methode wurde mit dem Form Taly Surf PGI Plus von Taylor Hobson durchgeführt. Das Gerät misst verschiedenste 3D-Oberflächengeometrien wie Radius, Neigung, Rauheit und Welligkeit. Für alle Messungen wurde ein 60-Grad-Taststift mit einem Spitzenradius von 2 μm verwendet, der eine vertikale Auflösung im Nanometerbereich ermöglicht.

2. Scannende Weißlichtinterferometrie: Diese berührungslose Messmethode wurde mit dem optischen Oberflächenprofilometer ZYGO NewView 7300 durchgeführt, das Profilhöhen von weniger als 1 nm bis zu mehreren Millimetern messen kann. Für Übersichtsmessungen wurde die Michelson-Anordnung mit einem 5x/0,25-Objektiv verwendet, während für kleine Bildfelder Mirau-Objektive mit 20x/0,4- und 50x/0,55-facher Vergrößerung eingesetzt wurden.

   Mikrorauheit:

   Die Oberfläche des Sakura-Tapes wies eine typische Mikrorauheit mit noppenartigen Strukturen auf, während die Deckglasoberfläche sehr glatt war (unterhalb des Detektionsrauschens). Diese Mikrostruktur wurde sowohl auf dem rohen Tape-Material als auch auf den mit Sakura-Tape abgedeckten Leer- und Gewebeproben beobachtet. Typische Werte von 5–6 nm RMS-Rauheit konnten mittels Weißlichtinterferometrie gemessen werden (Abbildung 1). Die mit dem taktilen Profilometer bestimmten Werte lagen geringfügig höher, bestätigten jedoch die raue Oberfläche der Polymerfolie (Abbildung 2). Eine mögliche Ursache könnte das im Vergleich zum Interferometeraufbau deutlich höhere Hintergrundrauschen des Profilometers in seiner Messumgebung sein.

   (Stichprobengröße: 7 Tape-Proben, darunter 2 Leerproben, 4 mit Gewebeschnitten und 1 Rohmaterialprobe (Tape))

Welligkeit:

Auf Objektträgern montiert zeigten beide Arten von Abdeckmedien Oberflächenwelligkeiten mit vergleichbaren PV- und RMS-Werten. Während Deckgläser jedoch eine sanfte Durchbiegung mit relativ großen Perioden zeigten (Abbildung 3), war die Tape-Oberfläche von charakteristischen unregelmäßigen Kräuselungen mit kleineren Perioden geprägt (Abbildung 4).

Die Werte für die biologischen Proben lagen im Allgemeinen 2- bis 3-mal höher als die der Leerproben. Dies wurde bei beiden Arten von Abdeckmedien beobachtet.

Bei den Tape-Proben wurde die Struktur der darunterliegenden Gewebeschnitte im Oberflächenprofil grob nachgebildet. Bei den Glasproben stand die Durchbiegung des Deckglases nahezu vollständig unabhängig von der Form des Gewebes (siehe Abbildung 5 und Abbildung 6).

Weitere Details sind in den entsprechenden Folien dokumentiert (Report_Praep_und_Leerproben-SK-2025-06-26.pdf).

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2.2 R/T-Messungen

Für Objektträger, Deckgläser sowie Sakura-Abdeckfolien wurden Messungen der wellenlängenaufgelösten Reflexion und Transmission im Wellenlängenbereich von 300 nm bis 1000 nm bei einem Einfallswinkel von 6° durchgeführt (siehe Abbildung 7, Abbildung 8, Abbildung 9). Zu diesem Zweck wurde ein kommerzielles Photospektrometer von PerkinElmer mit einem zusätzlichen internen Messaufsatz verwendet, der sicherstellt, dass die Reflexions- und Transmissionsdaten an exakt derselben Stelle der Probe bestimmt werden. Für Wellenlängen oberhalb von etwa 850 nm ist im Gerät ein Detektorwechsel erforderlich, der tatsächlich ein angepasstes Messregime notwendig macht (siehe z. B. Mitte von Abbildung 7). Dies wurde in der Studie nicht durchgeführt, da nur der VIS-Bereich von Interesse ist. Ist die Dicke einer homogenen Probe bekannt (in der Praxis lässt sich die Dicke relativ einfach und genau durch taktile Messungen bestimmen), können aus den beiden Messgrößen, d. h. Transmission und Reflexion, für jeden Wellenlängenpunkt der Real- und Imaginärteil des Brechungsindex berechnet werden. Da Lichtverluste in diesen Messungen nicht in einzelne Verlustkanäle getrennt werden, enthält der Imaginärteil sowohl Absorptions- als auch Streuanteile.

Abbildung 7 und Abbildung 8 zeigen R-T-Spektren und Brechungsindexdispersionen des Objektträgers und des Deckglases. Es ist zu erkennen, dass die beiden Proben hinsichtlich des Brechungsindex gut aufeinander abgestimmt sind. Die Verluste sind gering und nehmen erst unterhalb von 350 nm deutlich zu.

Bei der Abdeckfolie war es schwierig, die Dispersion aus den Spektraldaten zu bestimmen (weitere Informationen siehe Kapitel zur Ellipsometrie). Aus diesem Grund wird hier nur ein Vergleich der Spektraldaten von Abdeckfolie/Sakura-Folie und Deckglas gezeigt (siehe Abbildung 9). Die Transmissions- und Reflexionsdaten von Deckglas und Sakura-Abdeckfolie unterscheiden sich deutlich, insbesondere bei kurzen Wellenlängen unterhalb von 400 nm. Im Wellenlängenbereich von 400 bis 1000 nm zeigt das Sakura-Tape niedrigere Reflexions- und höhere Transmissionswerte als das Deckglas, was auf einen deutlich reduzierten Brechungsindex hinweist. Die Verluste (100 %-R-T) in der Folie sind deutlich höher als im Deckglas. Die Tape-Verluste steigen vom Minimalwert (etwas größer als 1 %) bei großen Wellenlängen zu kleineren Wellenlängen hin allmählich an. Dies ist vermutlich auf höhere Streuverluste an der Oberseite der Folie zurückzuführen (siehe Abbildung 1). Unterhalb von 400 nm kommt es zu einem starken Anstieg der Verluste von 3 % bei 400 nm auf 13 % bei 325 nm (vermutlich absorptionsdominiert).

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2.3. Ellipsometrische Messungen

Bei der Ellipsometrie wird eine Probe mit polarisiertem Licht unter verschiedenen Einfallswinkeln (_i bzw. numerischen Aperturen sin(_i) = _i) und bei unterschiedlichen Wellenlängen (λ) bestrahlt. Das reflektierte Licht (oder transmittierte Licht – wobei wir uns hier auf Reflexionsmessungen beschränken) wird mithilfe eines rotierenden Polarisationsanalysators ausgewertet. Die Messgröße wird häufig als Quotient der TM- und TE-Reflektivität (TE: transversal elektrisch, TM: transversal magnetisch) in Form der ellipsometrischen Winkel Ψ und Δ angegeben (siehe Abbildung 10, links). Ψ beschreibt das Verhältnis der Beträge der Reflektivitäten, während Δ die Phasendifferenz zwischen der TE- und TM-Reflexion darstellt. Beide Größen können eindeutig in die normierten Stokes-Parameter S1 und S2 umgerechnet werden. Die Ellipsometrie kann vorteilhaft zur Charakterisierung von Dispersionseigenschaften eingesetzt werden, insbesondere bei Vorliegen von Doppelbrechung. Im Rahmen des Projekts verwenden wir zwei verschiedene Arten der Ellipsometrie (siehe Abbildung 10, rechts), nämlich Standardellipsometrie mit Reduzierung der Rückseitenreflexion (Abbildung 10, oben rechts) und TIR-Ellipsometrie (Total Internal Reflection; Abbildung 10, unten rechts). Die letztgenannte Methode ermöglicht aufgrund der sehr großen Lichtausbreitungswinkel sowie des doppelten Lichtdurchgangs durch das Medium sehr empfindliche Aussagen über die Doppelbrechung von Materialien.

Wie im vorherigen Kapitel erläutert, traten bei der Dispersionscharakterisierung der Abdeckfolien mittels RT-Spektroskopie Probleme auf. Bei RT-Messungen unter einem Einfallswinkel von 6° müssen die Mehrfachreflexionen an Vorder- und Rückseite der Probe berücksichtigt werden. Die Rückseitenreflexionen an der Sakura-Folie wurden jedoch durch die Folienwelligkeit gestört, sodass die Modellierung über eine quasi-unendliche Reihe von Mehrfachreflexionen nicht mehr zuverlässig funktioniert. Die aus den RT-Messungen gewonnenen Dispersionsdaten waren zu ungenau. Diese Probleme können mit Standardellipsometrie bei Minimierung der Rückseitenreflexion umgangen werden. Die Charakterisierungen wurden für verschiedene Messkonfigurationen durchgeführt: unterschiedliche Einfallswinkel, unterschiedliche Probenorientierungen sowie Messungen an der Ober- oder Unterseite der Probe. Einige Beispielgraphen sind in Abbildung 11 dargestellt (siehe unterschiedlich gefärbte Kurven). Diese Untersuchungen zeigten, dass sich die Brechungsindizes nur geringfügig ändern:

1. in Abhängigkeit vom Einfallswinkel (longitudinale Doppelbrechung),
2. in Abhängigkeit von der Probenorientierung (transversale Doppelbrechung),
3. bei Einfall auf die Oberseite im Vergleich zur Unterseite der Abdeckfolie.

Daraus lässt sich schließen, dass das Sakura-Tape nur eine geringe Doppelbrechung aufweisen dürfte. Die Brechungsindizes auf der Oberseite der Folie und auf der Klebeseite der Folie stimmen im Rahmen dieses Messansatzes überein. Es zeigt sich jedoch, dass die Abdeckfolie einen deutlich niedrigeren Brechungsindex (>~0,03) als der Objektträger aufweist (vgl. die linken und rechten Diagramme in Abbildung 11), d. h., die Sakura-Abdeckfolie ist hinsichtlich des Brechungsindex nicht so ideal an den Objektträger angepasst wie das Deckglas.

Um die Doppelbrechung der Abdeckfolie quantitativ zu messen, ist eine empfindlichere Methode als die Ellipsometrie an einer einzelnen Grenzfläche erforderlich. Zu diesem Zweck wurde TIR-Ellipsometrie (siehe Abbildung 10, links) eingesetzt.

Wie erwartet zeigten die Messungen, dass Objektträger, Deckgläser und Proben mit Deckglas keine Doppelbrechung aufweisen (Details siehe entsprechende Folien: Ellipsometry_DM-2025-06-26.pdf). Im Gegensatz dazu wurde bei einzelnen Abdeckfolien sowie bei Proben mit Sakura-Tape Doppelbrechung nachgewiesen und quantifiziert. Abbildung 12 zeigt die entsprechenden Messungen der Polarisationsphasendifferenz Δ mittels TIR-Ellipsometrie für unterschiedliche Probenorientierungen und unterschiedliche Einfallswinkel bzw. numerische Aperturen (NA).

Zum Vergleich sind in Abbildung 12 ideale Simulationen für eine isotrope (nicht doppelbrechende) Schicht mit gleicher Schichtdicke und ähnlichen isotropen Dispersionsdaten dargestellt (siehe graue Kurven). Alle Messungen mit Sakura-Tape zeigen deutliche Abweichungen von diesen isotropen Simulationen, d. h., in allen Messsituationen liegt Doppelbrechung vor. Die Untersuchungen einzelner Abdeckfolien deuten darauf hin, dass die Phasendifferenzen Δ für verschiedene Probenorientierungen annähernd gleich sind. In Abbildung 12 sind nur zwei zueinander senkrechte Orientierungen dargestellt. Die roten Kurven zeigen Messungen entlang der Längsausdehnung der Abdeckfolie, die magentafarbenen Kurven die Phasen entlang der kurzen Seite. Die Phasendifferenzen Δ ändern sich bei unterschiedlichen Einfallswinkeln bzw. numerischen Aperturen. Somit weist die Einzelfolie eine uniaxiale Doppelbrechung auf, wobei die optische Achse parallel zur Schichtnormalen verläuft. Die beiden identischen Hauptachsenindizes liegen in der Schichtebene, während die dritte Hauptachse mit einem veränderten Brechungsindex senkrecht zur Schicht steht. Bei numerischen Aperturen in der Größenordnung von NA ≈ 1 treten TE-TM-Phasendifferenzen von etwa π/2 auf, was einer potenziell signifikanten Änderung des Polarisationszustands entspricht. Bei größeren NA nimmt diese Phasendifferenz weiter zu.

Das doppelbrechende Verhalten ändert sich, wenn die Sakura-Folie auf einen Objektträger aufgebracht wird. Obwohl die Phasendifferenzen bei Messungen entlang der kurzen Seite der Probe gleich bleiben wie bei Einzelschichten (siehe blaue Kurven in Abbildung 12), nehmen die Δ-Werte mit zunehmender Probendrehung allmählich ab. Minimale Phasendifferenzen liegen entlang der Längsseite der Probe vor (siehe grüne Kurven in Abbildung 12). Die Folie wird dadurch optisch biaxial. Dieses Verhalten wurde sowohl bei Blindproben als auch bei Proben mit Objekten beobachtet, wobei die quantitativen Werte der Doppelbrechung von Probe zu Probe variieren können (siehe PDF-Folien).

Die Hauptachsen-Brechungsindizes nx, ny und nz der Sakura-Folie können aus den Ellipsometermessungen berechnet werden. Abbildung 13 zeigt, dass die Unterschiede der Hauptachsen-Brechungsindizes (Δ < 5 × 10^-4) recht klein sind. Die großen Phasendifferenzen Δ bei derart kleinen Brechungsindexunterschieden lassen sich durch die große Foliendicke von etwa 150 μm erklären, d. h., selbst bei geringer Doppelbrechung akkumuliert das Licht während der Ausbreitung durch das Tape große Phasendifferenzen.

Abschließend ist festzuhalten, dass bei den Messungen in Abbildung 12 die Amplituden der hochfrequenten Oszillationen deutlich kleiner sind als in den Simulationen. Der Grund hierfür scheinen die Oberflächenwelligkeiten des Folienmaterials zu sein, die solche Interferenzeffekte im Tape unterdrücken.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass bei standardmäßigen mikroskopischen Untersuchungen (moderate NA-Werte, Hellfeldbeleuchtung) kein Einfluss der Doppelbrechung auf die Bildqualität zu erwarten ist. Der Grund hierfür sind die nur geringen Unterschiede zwischen den Hauptbrechungsindizes des Indexellipsoids. Bei Anwendungen mit hoher NA (NA > 1) und insbesondere in der Polarisationsmikroskopie werden jedoch aufgrund der großen TE-TM-Phasendifferenzen Effekte sichtbar werden.

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3. Optische Simulationen

3.1. Optisches Modell der Leica Scanneroptik

Die folgenden optischen Spezifikationen des Leica-Objektträgerscanners wurden vom Projektpartner bereitgestellt: 

• kundenspezifisches Plan-APO-Objektiv, f = 10 mm, NA 0,65
• kundenspezifische Tubuslinse, f = 400 mm
• Abstand Austrittspupille – Tubuslinse: ~ 140 mm
• Mikroskopvergrößerung: 40×
• Objektfeld: Ø 1,25 mm (1,08 mm genutzt)
• Kamerafeld: Ø 43 mm
• Abbildungsverfahren: ausschließlich Hellfeld
• Probendicke des Gewebes: ~ 4 μm

Auf Grundlage dieser Parameter wurde mit der optischen Designsoftware ZEMAX ein vereinfachtes optisches Modell erstellt.

In der Austrittspupille des Objektivs musste eine zusätzliche Zernike-Fläche eingeführt werden, um den durch das Deckglas verursachten sphärischen Fehler (0,44 λ primäre sphärische Aberration) zu kompensieren. In der realen Auslegung wird dieser Fehler durch das optische Design des Objektivs kompensiert, das an das Deckglas angepasst sein muss.

Da die realen Designdaten von Leica nicht bereitgestellt werden konnten, wurden ideale Linsen verwendet (paraxiales Linsenmodell in ZEMAX). Aufgrund der hochkorrigierten Optik in Mikroskopsystemen ist dies weitgehend gerechtfertigt. Allerdings weist dieses Modell einige kleinere Einschränkungen auf:

• ZEMAX-Ideallinsen erfüllen die Abbe’sche Sinusbedingung nicht (numerische Apertur und Austrittspupillendurchmesser stimmen nicht exakt überein!).
• Polarisationseffekte können nicht vollständig modelliert werden (Glas- bzw. Beschichtungsdaten wurden vom Kunden nicht zur Verfügung gestellt).
• Die Aberrationen des realen Systems sind unbekannt, sodass der absolute Wert der Linsenleistung unter dem Einfluss der Eindeckmedien nur schwer zu beurteilen ist.

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3.2. Modellierung von Deckglasinhomogenitäten in Zemax

Die gemessenen Abweichungen der Deckglas- und Tape-Proben von einer idealen planparallelen Platte wurden durch eine der folgenden mathematischen Funktionen modelliert:

a) ZEMAX-„bikonische Fläche“:

Bikonische Flächen eignen sich zur Modellierung von Wölbungen oder Sattelflächen, die typisch für Deckglasverformungen sind:

b) ZEMAX-„periodische Fläche“:

Dieser Flächentyp kann verwendet werden, um die Welligkeiten zu modellieren, die üblicherweise auf Deckfolien gemessen werden.

Deckglas- und Tape-Proben wurden mit den aus den Oberflächenprofilmessungen gewonnenen Daten modelliert. Die Analysen wurden sowohl für Blindproben (ohne biologische Schnitte) als auch für reale Proben (mit Gewebeschnitten) durchgeführt.

Die PV-Werte (Peak-to-Valley) der Oberflächenunregelmäßigkeiten von Glas- und Tape-Proben liegen in ähnlichen Bereichen (0,1 … 10 μm). Im Vergleich zu den Deckglasproben waren die Perioden der Tape-Verformungen jedoch typischerweise deutlich kleiner, und die Form der Verformungen war unregelmäßiger (vgl. Abbildung 18 und Abbildung 19). Die Werte der biologischen Proben waren sowohl bei Glas als auch bei Tape etwa zwei- bis dreimal höher als die der Blindproben.

Zur Bewertung des Einflusses der Störungen auf die Bildqualität wurden hauptsächlich die folgenden optischen Leistungskriterien herangezogen:

• Strehl-Zahl als integrales Maß für die optische Leistungsfähigkeit. Sie ist definiert als das Verhältnis der Spitzenintensität der aberrierten Punktspreizfunktion (PSF) zur idealen (beugungsbegrenzten) PSF.
• Modulationsübertragungsfunktion (MTF), die die Übertragung des Kontrasts vom Objekt zum Bild in Abhängigkeit von der Ortsfrequenz beschreibt.

Zusätzlich wurden Verzeichnungsanalysen und Bildsimulationen durchgeführt.

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3.3. Results of modeling:

The following conclusions can be drawn from the optical simulations. Detailed results are contained in the corresponding slides (OpticalSimulation-abod-28-5-25-final.pdf).

For the cover glass samples, nearly no noticeable deterioration in optical performance was obtained. There was no difference between the blank and the tissue samples relevant in praxis. Typically, contrast drop was below 0.1 % according to the modulation transfer function (MTF). In case of the tape samples, the simulations revealed a field-dependent degradation of image quality. MTF contrast showed local deteriorations in the range of 5-20 % for mid-range frequencies (Figure 20).

Da optische Simulationen des gesamten Sichtfeldes mit realen Gewebefotografien nur schwer zu bewerten sind, wurde stattdessen ein digitales Auflösungstestmuster verwendet, und es wurden Probenbereiche von 150 × 150 μm untersucht. Die Grenzfrequenz der Scanneroptik liegt gemäß den Designdaten bei etwa 1 μm. Daher erschien ein Liniengitter mit einer Periode von 1,5 μm geeignet. Für die Simulationen wurden typische PV-Werte und Perioden verwendet, die für die verschiedenen Eindeckmedien gemessen wurden.

Bildsimulationen für das Deckglas zeigen eine nahezu konstante Auflösung über das gesamte Feld (siehe Abbildung 21). Für das Eindecktape zeigten die Simulationen in bestimmten Bereichen einen reduzierten Kontrast und eine verringerte Auflösung (siehe Abbildung 22). Es ist jedoch zu beachten, dass diese Effekte nur an der Auflösungsgrenze des Mikroskops auftreten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Deckgläser sanfte Durchbiegungen mit relativ langen Perioden aufweisen, was nur geringe Auswirkungen auf die optische Leistung hat. Im Gegensatz dazu werden die Tape-Oberflächen von unregelmäßigen Welligkeiten mit kleineren Perioden dominiert. Diese Störungen können die optische Leistung in bestimmten Bereichen der Probe an der Auflösungsgrenze beeinträchtigen.

Auf kleinerer Skala weist das Eindecktape eine deutlich rauere Oberfläche auf als das Deckglas (vgl. Abbildung 1), was Lichtstreuung und einen reduzierten Kontrast im gesamten Bild verursachen könnte. Für eine quantitative Bewertung der Streueffekte wäre eine weiterführende optische Modellierung erforderlich, die nicht Bestandteil der Arbeitspakete war. Dies könnte in einer Folgestudie untersucht werden, zusammen mit einer Untersuchung der Fluoreszenz verschiedener Eindeckmedien und deren Einfluss auf die Bildqualität.

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4. Messung von Oberflächenkratzern und Kontamination

Auf Wunsch des Kunden wurde eine zusätzliche optische Inspektion von jeweils drei Blindproben jedes Eindeckmediums durchgeführt, um Verunreinigungen und Defekte auf der Oberfläche der Eindeckmedien zu detektieren. Zu diesem Zweck wurde ein LEICA INM300 Wafer-Inspektionsmikroskop mit einem 2,5×/0,07-Objektiv verwendet. Die Defekte wurden mit der Bildverarbeitungssoftware ImageJ automatisch erfasst und gemäß ISO 10110-7 kategorisiert.

Für alle sechs Proben wurden die folgenden Schritte angewendet:

1. Die Proben wurden mit optischen Reinigungstüchern (Prosat PS-911, getränkt mit einer Lösung aus 70 % Isopropanol und 30 % deionisiertem Wasser) vorgereinigt und mit sauberem Stickstoff abgeblasen.
2. Ein erster mikroskopischer Defekt-Scan wurde durchgeführt.
3. Die Proben wurden eine Woche lang in einem standardmäßigen Optiklabor (ohne Reinraumklassifizierung) gelagert, um eine übliche Partikelbelastung zu simulieren.
4. Die Proben wurden erneut mit Stickstoff abgeblasen.
5. Ein zweiter mikroskopischer Defekt-Scan wurde durchgeführt.

Repräsentative Defektkarten (Overlay-Projektion von 2 × 2 mm großen Teilaufnahmen) von Glas- und Tape-Proben vor und nach einer Woche Exposition sind in Abbildung 23 und Abbildung 24 dargestellt. Aufgrund der großen Schärfentiefe des verwendeten Objektivs (~ 120 μm) sind auch Defekte zwischen Deckglas und Objektträger sichtbar (leicht unscharf).

Die folgenden Beobachtungen wurden gemacht:

1. Die mit Tape eingedeckten Proben wiesen bereits vor der Exposition gegenüber der Laborluft etwa fünfmal mehr Defekte auf als die mit Glas eingedeckten Proben (Abbildung 25).
2. Nach einwöchiger Lagerung im Labor zeigten die mit Tape eingedeckten Proben ein deutlich geringeres Partikelwachstum als die mit Glas eingedeckten Proben (Abbildung 26).
3. Bei den Eindecktape-Proben war eine gewisse Anzahl von Kratzern in Längsrichtung vorhanden, die bei den Deckglasproben nicht zu sehen waren (vgl. Abbildung 24).

Bei der Interpretation der Ergebnisse sollten die folgenden Einschränkungen berücksichtigt werden: 

• Die Anzahl der Proben (3 × Glas, 3 × Tape) ist für eine zuverlässige statistische Auswertung zu gering.

• Die „Historie“ der Proben war nicht oder nur unzureichend dokumentiert. Dies umfasst sowohl die mechanische Handhabung der Proben als auch die Behandlung der Eindeckoberflächen (mechanisch oder mit Reinigungsmitteln).

  Dieses Arbeitspaket umfasste keine optische Simulation im Zusammenhang mit den Defekten. Da die Scannerauflösung jedoch etwa 1 μm beträgt, ist bei typischen Defektgrößen im Mikrometerbereich mit einer Verschlechterung der optischen Leistung zu rechnen. Aufgrund der geringen Schärfentiefe der Objektträgerscanner-Optik (1–2 μm) gilt dies insbesondere für Defekte, die sich zwischen dem Eindeckmedium und dem Objektträger befinden (z. B. Einschlüsse und Blasen).

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5. Zusammenfassung

Die Ergebnisse der Vergleichsstudie lassen sich wie folgt zusammenfassen:

Deckglas- und Tape-Medien zeigen deutliche Unterschiede in der Oberflächentextur. Erstens weisen Tape-Oberflächen eine typische knotige Mikrorauheit im Nanometerbereich auf. Im Vergleich dazu ist Glas durch eine sehr glatte Oberfläche gekennzeichnet, die unterhalb des Messrauschens liegt. Zweitens zeigen Tape-Proben bei Betrachtung auf größerer Skala eine unregelmäßige Welligkeit mit Perioden von einigen hundert Mikrometern. Im Gegensatz dazu sind Glasproben durch eine regelmäßigere Welligkeit mit Perioden im Millimeterbereich gekennzeichnet.

Beide Oberflächeneigenschaften des Tape-Materials können die Bildqualität des mikroskopischen Bildes beeinträchtigen: In den optischen Simulationen konnte gezeigt werden, dass die Tape-Welligkeiten Kontrast und Auflösung am Rand der Auflösungsgrenze des Objektivs verschlechtern. Streulicht, das durch die Mikrorauheit des Folienmaterials verursacht wird, könnte den Kontrast im Bild verringern. Da Streulichtsimulationen nicht Bestandteil des Projekts waren, können hierzu keine quantitativen Aussagen getroffen werden.

Aus den R/T-Messungen konnte gezeigt werden, dass die Sakura-Eindeckfolie nicht so ideal an den Objektträger indexangepasst ist wie das Deckglas, was bei hohen numerischen Aperturen zu leicht erhöhten sphärischen Aberrationen im mikroskopischen Bild führen kann. 

Darüber hinaus zeigen die Messungen, dass das Tape-Material im Vergleich zum Deckglas etwa 1–2 % höhere optische Verluste aufweist, was vermutlich auf Streulicht an der raueren Oberfläche der Folie zurückzuführen ist. Zusätzlich tritt beim Tape im Gegensatz zum Deckglas unterhalb von 350 nm eine erhöhte Absorption auf.

Auf Basis der ellipsometrischen Messungen können wir schließen, dass bei der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie mit moderaten numerischen Aperturen, wie sie beim Leica-Objektträgerscanner vorliegt, kein Einfluss der Doppelbrechung auf die Bildqualität zu erwarten ist. Diese Effekte würden jedoch bei Anwendungen mit hoher numerischer Apertur sichtbar werden, insbesondere im Zusammenhang mit der Polarisationsmikroskopie.

Hinsichtlich Oberflächendefekten wiesen die Tape-Proben etwa fünfmal mehr Defekte auf als die mit Glas eingedeckten Proben. Im Gegensatz zu den Glasproben waren Kratzer entlang der Länge der Tape-Proben unter dem Mikroskop deutlich sichtbar. Die Tape-Oberflächen zeigten jedoch während einer Expositionszeit von einer Woche im Labor ein deutlich geringeres Partikelwachstum als die mit Glas eingedeckten Proben.

Die Ergebnisse der Defekt-Scans sollten aufgrund der begrenzten Anzahl der untersuchten Proben mit Vorsicht interpretiert werden.

Probenumfang: 6 Glasproben, darunter 2 Blindproben, 3 mit Gewebeschnitten („Haut“, „Fettgewebe“, „Biopsie“) und 1 Rohmaterialprobe (Deckglas). 7 Tape-Proben, darunter 2 Blindproben, 4 mit Gewebeschnitten und 1 Rohmaterialprobe (Tape). *(als Fußnote)*

Die Ergebnisse spiegeln diese standortspezifische Einzelbewertung mit spezifischen Instrumenten, Protokollen und Probenzusammensetzung wider. Die Ergebnisse können je nach Laborumgebung, Probentypen und Arbeitsablauf variieren. Die Studie bewertete ausschließlich die technische/optische Leistungsfähigkeit und untersuchte weder die klinische diagnostische Genauigkeit noch patientenbezogene Ergebnisse. 

1. Coverslip material can influence digital image quality and consistency.
2. Glass coverslips demonstrate a smoother surface texture compared to polymer film.
3. Polymer film coverslips may increase the likelihood of visual irregularities that can impact image clarity.
4. Surface flatness and consistency are important factors in digital image quality.
5. Surface imperfections, including roughness, scratches, or contamination, may contribute to imaging artifacts and rescans.
6. Glass coverslips may offer advantages for high-throughput digital pathology workflows.