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Tinciones especiales: ¿cuál, cómo y por qué? Parte I: Mucinas y glucógeno

Definir “tinción especial”

“Tinción especial” es un término utilizado para referirse a muchas técnicas de tinción alternativas que se utilizan cuando la H&E tradicional no proporciona toda la información que el patólogo o investigador necesita de una preparación de tejido. Las “tinciones especiales” son procesos que generalmente emplean un tinte o un producto químico que tiene una afinidad con el componente tisular particular que se quiere evidenciar. Permiten ver microscópicamente la presencia/ausencia de ciertos tipos de células, estructuras y/o microorganismos. Las “tinciones especiales” no son lo mismo que las técnicas inmunohistoquímicas (IHC) y/o moleculares (sondas), y, de hecho, existían mucho antes que estas.

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Mucinas: introducción

Las mucinas forman parte de un grupo complejo llamado carbohidratos. Se pueden definir simplemente como azúcares y almidones. Los carbohidratos se dividen en monosacáridos, polisacáridos y mucopolisacáridos. Las mucinas son mucopolisacáridos, los cuales consisten en largas cadenas de moléculas de azúcar que se encuentran en todo el cuerpo y son esenciales para la vida y significativas para mantener la integridad estructural de los huesos, cartílagos, piel, tejido elástico y membranas. Son importantes en el crecimiento celular ya que ayudan a regular el flujo de nutrientes entre los capilares y las células y se les conoce como "El pegamento de la vida".

Hay dos amplias categorías de mucinas:

Mucinas ácidas, que tienen una carga negativa en las moléculas de mucina y pueden clasificarse como simples (grupo carboxilo añadido) o complejas (grupo ácido sulfúrico añadido). Se encuentran en grandes cantidades en las vías respiratorias y gastrointestinales.

Mucinas neutras, que carecen de grupos ácidos y no tienen carga. Se encuentran en el epitelio del estómago y en las glándulas de Brunner del duodeno. Protegen el revestimiento del duodeno del contenido del ácido estomacal, contribuyen a la absorción proporcionando un entorno alcalino para las enzimas digestivas y lubrican las paredes intestinales y el epitelio prostático.

Mucinas ácidas: las tres tinciones más utilizadas para mostrarlas

1) Azul alcián

El azul alcián es un tinte básico que contiene cobre, que le da el color azul. Las moléculas de tinción tienen una carga positiva y son atraídas por las mucinas negativas. El ajuste del pH de la solución de azul alcián permite evidenciar subtipos de mucinas ácidas.

pH 2,5: se considera una tinción de mucina completa, que mostrará:

  • Mucinas simples carboxiladas (baja acidez) como el tejido conjuntivo y el cartílago
  • Células caliciformes en el esófago de Barrett

pH 1,0: mostrará mucinas complejas sulfatadas (alta acidez) en:

  • Células caliciformes intestinales grandes
  • Glándulas serosas bronquiales
  • Adenocarcinomas

Ejemplos de tejido normalmente con tinción positiva para mucina con el proceso de azul alcián:

  •  Células caliciformes intestinales
Células caliciformes intestinales
  • Células caliciformes del esófago de Barrett
Células caliciformes del esófago de Barrett
  •  Cápsulas mucoides de organismos: Cryptococcus
Cápsulas mucoides de organismos: Cryptococcus
  • Gránulos de mastocitos: células inmunocompetentes que se encuentran en casi todos los tejidos y funcionan como centinelas de las respuestas inmunitarias.
Gránulos de mastocitos

Ejemplos de procesos de enfermedades identificados por el azul alcián:

  • Tumores mucinosos

    • Los carcinomas compuestos por al menos un 60 % de mucosidad se conocen como carcinomas mucinosos
    • Los tumores mucinosos constituyen aproximadamente el 10-15 % de todos los adenocarcinomas
    • Adenocarcinoma confirmado como productor de mucina

Tumores mucinosos

  • Mixedema: un tipo de hinchazón (edema) con depósitos anómalos de mucina en la piel y otros tejidos.

    • Mixoma: un tumor benigno raro del corazón que puede crecer hasta obstruir el flujo sanguíneo y que puede ser mortal.

Mixedema


Tipo de tejido

Composición

Azul alcián 2,5

Azul alcián 1,0

Tracto gastrointestinal

Mucinas neutras

Negativo

Negativo

Próstata

Mucinas neutras

Negativo

Negativo

Células caliciformes

Mucinas ácidas: simples

Positivo

Negativo

Estroma tisular

Mucinas ácidas: simples

Positivo

Negativo

Adenocarcinomas

Mucinas ácidas: complejas

Negativo

Positivo

Cartílago, hueso

Mucinas ácidas: complejas

Negativo

Positivo pH 0,5


Nota: El azul alcián no tiñe las mucinas neutras

El proceso

El Protocolo : los tiempos de incubación pueden variar según el fabricante

1.

Poner la preparación en agua

2.

Azul alcián: vaya con cuidado al seleccionar el pH adecuado

30 min

3.

Enjuagar bien con agua corriente

2 min

4.

Contratinción en rojo nuclear sólido

2 min

5.

Enjuagar brevemente con agua corriente

6.

Deshidratar, aclarar y montar

 

Solución de problemas de la tinción con azul alcián:

El rojo nuclear sólido debe mezclarse bien antes de su uso para obtener mejores resultados, ya que tiende a sedimentarse en la solución, y no dará una buena contratinción. Asegúrese de utilizar el pH adecuado de azul alcián para evitar un posible falso negativo.

2) Hierro coloidal

El hierro coloidal se utiliza para distinguir mucinas ácidas. Se utiliza a menudo para sustituir la tinción de azul alcián debido a su mayor sensibilidad para mucinas ácidas con detección de cantidades muy pequeñas. También se utiliza para diagnosticar algunos carcinomas de células renales y algunos mesoteliomas, una forma rara de cáncer que se desarrolla a partir de células transformadas que se originan en el mesotelio (revestimiento protector que cubre muchos órganos internos).

Hierro coloidal

El proceso

Los iones de hierro (férricos) cargados positivamente son atraídos por las moléculas negativas de la mucina. A continuación, los iones de hierro unidos se tratan con ferrocianuro de potasio/HCL para formar depósitos visibles de color azul brillante.

Los iones de hierro (férricos) cargados positivamente son atraídos por las moléculas negativas de la mucina. A continuación, los iones de hierro unidos se tratan con ferrocianuro de potasio/HCL para formar depósitos visibles de color azul brillante.
Resultados: Mucinas ácidas: azul intenso, núcleos: rojo rosado, citoplasma: rosa
Resultados: Mucinas ácidas: azul intenso, núcleos: rojo rosado, citoplasma: rosa

El Protocolo: los tiempos de incubación pueden variar según el fabricante

1.

Poner las preparaciones en agua

2.

Incubar en GLAA (ácido acético glacial) al 12 %

12 min

3.

Pasar directamente a la solución de hierro coloidal de trabajo

60 min

4.

Enjuagar en GLAA al 12 %

3 min

5.

Enjuagar en segunda solución de GLAA al 12 %

3 min

6.

Ferrocianuro y solución de ácido clorhídrico

20 min

7.

Enjuagar con agua corriente

2 min

8.

Contratinción en rojo nuclear sólido

5 min

9.

Enjuagar brevemente con agua corriente

10.

Deshidratar, aclarar y montar

Resolución de problemas de la tinción con hierro coloidal – Trabajar con una tinción con hemosiderina no específica:

  • Disponga dos preparaciones idénticas etiquetadas como A y B
  • Incube la preparación A durante todo el protocolo
  • Incube la preparación B una vez rehidratada en una solución de ferrocianuro de potasio con HCL solamente
  • Al analizar el tejido de prueba, ignore cualquier tinción de la preparación B que pueda verse en la preparación A

3) Mucicarmina: una tinción muy específica para mucina de origen epitelial

Antes de que se dispusiera de procedimientos inmunohistoquímicos, se utilizaba la tinción con mucicarmina para verificar la presencia de carcinoma con anillo de sello, una forma poco frecuente de adenocarcinoma altamente maligno que produce mucina. Se trata de una neoplasia maligna epitelial caracterizada por la apariencia histológica de células en anillo de sello.

El carcinoma de células en anillo de sello se muestra mediante tres métodos:

Métodos de carcinoma de células en anillo de sello

La tinción con mucicarmina también se utiliza para diferenciar entre carcinoma escamoso negativo para mucina y adenocarcinoma positivo para mucina.

carcinoma escamoso negativo para mucina y adenocarcinoma positivo para mucina

Ejemplo adicional de tinción positiva con mucicarmina:

tinción positiva con mucicarmina

El proceso

El carmín, un colorante obtenido de los cuerpos pulverizados de la cochinilla, se une a la solución con sales de aluminio (un proceso denominado mordentado) muy similar a la hematoxilina. Esto produce un complejo con carga positiva que es atraído por la molécula negativa para la mucina ácida.

Carmín: el proceso

El Protocolo: los tiempos de incubación pueden variar según el fabricante

-

Poner las preparaciones en agua

-

Hematoxilina de Weigert de trabajo

5-10 min

-

Enjuagar con agua corriente

-

Solución de mucicarmina de trabajo

20-30 min

-

Enjuagar con agua corriente

-

Amarillo metanil

1-3 min

-

Enjuagar brevemente con agua corriente

-

Deshidratar, aclarar y montar

 

Resolución de problemas de la tinción con mucicarmina:

Siga las instrucciones del fabricante para hacer que la mucicarmina funcione. Recuerde diluirla de acuerdo con las instrucciones y utilizar el agua adecuada para la dilución (destilada o corriente). Si deja la preparación más tiempo en una solución inadecuada o si realiza la tinción con mucicarmina sin diluir, no obtendrá los resultados que desea. Use hematoxilina de Wiegert fresca: si esta no tiene un color morado, sino más bien marrón, significa que se ha descompuesto y sus núcleos no se teñirán correctamente. La solución de trabajo de Wiegert puede durar un día completo, pero normalmente no toda la noche. No abuse del amarillo de metanilo, ya que es una contratinción.

Mucosa del colon
Mucosa del colon

Mucinas neutras: la tinción más común utilizada para evidenciar elementos

1) Ácido peryódico de Schiff - PAS

El ácido peryódico de Schiff proporciona la más versátil de las tinciones de carbohidratos, mostrando mucinas neutras y, como se indica a continuación, glucógeno. Reconoce mucinas ácidas simples no sulfatadas en células epiteliales y no depende de la carga negativa de las células de mucina, sino de la estructura de las unidades de sacáridos.

El proceso

Proceso

El Protocolo : los tiempos de incubación pueden variar según el fabricante

-

Poner las preparaciones en agua

-

Oxidar en ácido peryódico al 0,5 %

5 min

-

Solución de Schiff

15 min

-

Enjuagar con agua corriente

5 min

-

Hematoxilina de Mayer

1 min

-

Enjuagar con agua corriente

1 min

-

Deshidratar, aclarar y montar

Mucinas ácidas y mucinas neutras: cómo evidenciar ambas en la misma preparación

1) Azul alcián: PAS

El proceso

El azul alcián tiñe las mucinas ácidas y las mucinas neutras se tiñen con PAS positivo

El azul alcián tiñe las mucinas ácidas y las mucinas neutras se tiñen con PAS positivo

Resultados:

Azul alcián: PAS

El protocolo: los tiempos de incubación pueden variar según el fabricante

1.

Poner las preparaciones en agua

2.

Azul alcián

15 min

3.

Enjuagar con agua corriente

12 min

4.

Ácido peryódico

5 min

5.

Enjuagar con agua corriente

6.

Solución de Schiff

10 min

7.

Enjuagar con agua corriente

5 min

8.

Hematoxilina de Mayer

1 min

9.

Enjuagar con agua corriente

10.

Deshidratar, aclarar y montar

 Solución de problemas de la tinción con azul alcián - PAS:

  • Use azul alcián a pH 2,5
  • Asegúrese de que el ácido peryódico sea fresco
  • Guarde el reactivo de Schiff según las directrices del fabricante

Glucógeno: introducción

La glucosa es la principal fuente de energía para las células. El exceso de glucosa se almacena en el hígado y en los músculos. Esta forma almacenada de glucosa se denomina glucógeno. Cuando el cuerpo no obtiene suficiente glucosa de los alimentos, descompone el glucógeno para liberar glucosa en el torrente sanguíneo.

Cómo evidenciar el glucógeno:

Ácido peryódico de Schiff - tinción PAS: se utiliza para mostrar el glucógeno en el hígado, la membrana basal, ciertos tumores de la vejiga, el riñón, el páncreas y el ovario, y los hongos.

Ejemplos de tejido que normalmente se tiñen con PAS:

Hongos
Hongos
Membrana basal
Membrana basal

La presencia de glucógeno y sus patrones de distribución son significativos en enfermedades como:

  • Enfermedad por almacenamiento de glucógeno en el hígado

  • Enfermedad de Pompe: la acumulación de glucógeno causa debilidad muscular progresiva (miopatía) en todo el cuerpo y afecta a diversos tejidos corporales, especialmente en el corazón, los músculos esqueléticos, el hígado y el sistema nervioso

  • Rabdomiosarcoma: un cáncer del tejido conjuntivo

  • Mesotelioma

El proceso

La presencia de glucógeno y sus patrones de distribución son significativos en las enfermedades

Solución de problemas de la tinción PAS:

Es importante que el ácido peryódico permanezca sin diluir y fuerte. Lea el folleto del envase del reactivo de Schiff para saber cómo almacenar adecuadamente el producto.

Cómo mostrar el glucógeno real:

PASD: ácido peryódico de Schiff con diastasa

La diastasa es un extracto de malta que contiene extractos de alfa y beta amilasa, una enzima que ayuda en la conversión de almidones y azúcares. Esta amilasa descompone el glucógeno en moléculas de azúcar más pequeñas que luego se eliminan.

Cómo realizar una digestión de diastasa para diferenciar el glucógeno de otras moléculas positivas para PAS:

  1. Coloque dos secciones de tejido idénticas, una por portaobjetos
  2. Trate la preparación A con agua o una solución tampón.
  3. Trate la preparación B con diastasa (0,25 g de α-amilasa disueltos en 50 ml de agua destilada)
  4. Tiña ambas preparaciones con PAS según el protocolo anterior
  5. Deshidratar, aclarar y montar

Resultados:

Slide A shows a strong PAS reaction
Slide A shows a strong PAS reaction
Slide B staining disappears after diastase digestion
Slide B staining disappears after diastase digestion

Se supone que las áreas que son positivas para PAS en la preparación no tratada (A) y negativas para PAS en la preparación tratada (B) son glucógeno real. El PAS positivo en ambas preparaciones es otro material positivo para PAS no descompuesto por la enzima.

Resolución de problemas del PASD:

Asegúrese de que el ácido peryódico sea fresco y que la solución de Schiff sea estable. Asegúrese de que la enzima que está utilizando sea la correcta (es importante). Diluya la enzima de acuerdo con las especificaciones del protocolo y recuerde que el positivo para PAS que desaparece después de la digestión es el glucógeno. En este caso, un negativo significa un positivo.

Consejo: Si la enzima adecuada no está disponible comercialmente, puede usar su propia saliva, ya que la saliva humana es una gran enzima digestiva para descomponer el glucógeno.

References

Bibliografía

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Dorst, Dick. “The Role of Mucopolysaccharides in Good Health.” Aquaculture, INC., 2012.

Shaikh, Dr.Imran,“SpecialStainsinHistopathology.” KemHospital,2012

Ellis, Roy. “Alcian Blue and PAS Staining Protocols.” IMVS Division of Pathology, The Queen Elizabeth Hospital, Woodville, South Australia

Mowry, RW. J. Histochem.Cytochem., 4, 407, 1956

Myers, Dr. Russell. “Special Stain Techniques For The Evaluation Of Mucins.” Leica Biosystems.

Pernick, Nat, M.D. “Mucins.” Pathology Outlines Jan 26, 2016

Sheehan/Hrapchak. “Theory and Practice of Histotechnology.” Carbohydrates. 2nd edition, 9: 159-178

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