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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Mikrotomie und Anfertigung von Paraffinschnitten

Die Erstellung erstklassiger Paraffinschnitte am Rotationsmikrotom erfordert Geschick und viel Erfahrung. „Mikrotomie und Anfertigung von Paraffinschnitten“ ist ein super Ausgangspunkt für Mikrotomieeinsteiger und eine ausgezeichnete Gelegenheit zur Auffrischung der Kenntnisse erfahrener Anwender. Alle wesentlichen Aspekte des Schneidens von Paraffinschnitten werden angesprochen, einschließlich:

  • Sicherheit
  • Einrichtung des Mikrotoms
  • Mikrotomklingen
  • Grobbearbeitung und Trimmen von Blöcken
  • Techniken für gleichmäßige Paraffinschnitte
  • Wartung des Mikrotoms
  • Häufige Fehler bei der Mikrotomie
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Schritte zu einer besseren Mikrotomie + Aufschwimmen + Schnitttrocknung

Auf ihrem Weg vom Patienten zum Pathologen erfordert die Vorbereitung einer Gewebeprobe für die histologische Untersuchung Sorgfalt, Geschick und verlässliche Verfahren. Dieser Leitfaden gibt praktische Ratschläge zu bewährten Methoden und erklärt, wie häufige Fehler vermieden werden können.

Tipps für eine bessere Mikrotomie, das Aufschwimmen und die Schnitttrocknung sind in diesem Handbuch hervorgehoben. Die einzelnen Schritte sollen helfen, die gute histologische Praxis in Erinnerung zu rufen, und die Fehlersuche vereinfachen, wenn die Ergebnisse mal nicht zufriedenstellend sein sollten.

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Hochwertige Klingen verwenden

  Zum Schneiden werden immer hochwertige, scharfe Klingen verwendet.

  Die Klingen werden so lange wie möglich verwendet. Ein paar Zuglinien werden unumwunden akzeptiert und veranlassen nicht zum Klingenwechsel.

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A. Dieser Milzschnitt ist von zahlreichen feinen Linien durchzogen, die einer defekten Klinge geschuldet sind. H&E-Färbung.
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B. Diese Hautschnitte werden gerade aufgezogen. Es ist eine deutliche Messerlinie zu sehen, die quer durch das Gewebe verläuft. Solche Defekte sind beim Aufschwimmen leicht zu erkennen.

Einen optimalen Neigungswinkel einstellen

  Der Neigungswinkel des Messers wird immer für jedes Mikrotom und jeden Klingentyp angepasst.

  Der Neigungswinkel des Messers wird nie angepasst. Selbst wenn sich die Bedingungen ändern, ein neues Mikrotom zum Einsatz kommt, Klingentyp oder Wachs gewechselt werden, wird der Neigungswinkel nicht angepasst.

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Dieses kurze Schnittband, das aus einem kalten Block geschnitten wurde, zeigt Anzeichen einer deutlichen Kompression um 30-40 %. In diesem Fall konnte das Problem durch eine Neueinstellung des Neigungswinkels behoben werden.

Blöcke vorsichtig trimmen

  Die Blöcke werden sorgfältig getrimmt, um einen optimalen Zugang zum Gewebe zu erhalten. Um die Oberfläche zu glätten, werden die letzten Trimmschnitte in der Schichtdicke realisiert, die auch für die finalen Schnitte vorgesehen ist.

  Die Blöcke werden eilig zugeschnitten, um Zeit zu sparen. Eine Glättung der Oberfläche erfolgt nicht. Man geht direkt zur Schnitterstellung über. Dies führt oft zum Phänomen des Mottenfraßes, wobei die auszuwertenden Schnitte voller kleiner, ausgefranster Löcher sind.

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Dieses kurze Schnittband, das aus einem kalten Block geschnitten wurde, zeigt Anzeichen einer deutlichen Kompression um 30-40 %. In diesem Fall konnte das Problem durch eine Neueinstellung des Neigungswinkels behoben werden.
Hier wurden bei der Grobbearbeitung des Blocks Fragmente aus den tieferen Schichten herausgerissen. Im Schnitt sind deshalb zahlreiche Löcher auszumachen. H&E-Färbung.

Gefrierschäden vermeiden

  Die Blöcke werden auf einer kalten, feuchten Oberfläche gekühlt und ausschließlich kalt geschnitten. Schmelzendes Eis eignet sich hervorragend als Kühlfläche.

  Die Blöcke werden vor dem Schneiden eingefroren. Damit werden Risse im Gewebe in Kauf genommen.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
Dieser Block ist rissig, weil er vor dem Schneiden auf -15 °C gefroren wurde. Die Risse können das Schneiden und Aufschwimmen erschweren, da die Verbindung von Wachs und Gewebe an diesen Stellen aufgehoben ist.

Ausreichend gekühlte Blöcke schneiden

  Die Blöcke sind beim Schneiden immer kalt.

  Manchmal dauert es länger als erwartet, bevor die endgültigen Schnitte erstellt werden. In der Zwischenzeit mag sich der Block erwärmt haben, woraus sich ein Risiko für eine übermäßige Kompression ergibt.

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A. Die Verzerrung der Glomeruli in diesem Nierenschnitt ist auf eine übermäßige Kompression bei der Schnittdarstellung zurückzuführen. H&E-Färbung.
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B. Hier ist zu sehen, wie Schnitte aus demselben Block aufgezogen werden. Auf der linken Seite sind komprimierte Schnitte zu erkennen, die bei mangelhafter Kühlung erzeugt wurden, während die Schnitte auf der rechten Seite generiert wurden, als der Block ausreichend kalt war.

Schnitte langsam schneiden

  Die Schnitte werden in einer gleichmäßigen, langsamen Bewegung erzeugt.

  Die Schnitte werden so schnell wie möglich geschnitten. Man geht davon aus, dass sich jegliche Kompression beim Aufschwimmen im Wasserbad von selbst behebt.

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A. Dieses Leberpräparat nach Retikulin-Färbung zeigt ein feines Rattermuster, das durch zu schnelles Schneiden eines kalten Blocks aus sprödem Gewebe zu erklären ist. In diesem Fall konnte das Problem gelöst werden, indem der Block minimal erwärmt und dann sehr langsam geschnitten wurde. Rattermuster können auch entstehen, wenn der Paraffinblock oder die Klinge unzureichend befestigt sind.
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B. Dieser gefärbte Schleimhautschnitt zeigt gleichermaßen feine Rattermuster, die dem schnellen Schneiden eines sehr kalten Blocks geschuldet sind. H&E-Färbung.

In sauberem Wasser arbeiten

  Das Wasser im Wasserbad wird regelmäßig gewechselt.

  Das Wasser im Wasserbad wird regelmäßig nachgefüllt und nur gelegentlich ausgetauscht. Verunreinigungen im Bad können auf die Objektträger und unter die Schnitte gelangen, z. B. Staub und Schimmel.

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Dieser Schnitt durch die Serosa des Gastrointestinaltrakts wurde H&E-gefärbt. Innerhalb der Probe sind Cluster von schwach färbenden Mikroorganismen zu erkennen. Ähnliche Befunde ließen sich auch anderweitig auf dem Objektträger, außerhalb des eigentlichen Schnitts, erheben. Die Quelle dieser kontaminierenden Organismen war sehr wahrscheinlich das Wasserbad, in dem die Schnitte aufgezogen wurden.

Für saubere Objektträger sorgen

  Die Objektträger werden stets auf Sauberkeit kontrolliert, bevor sie verwendet werden. Die Handhabung und Berührung der Objektträger wird auf ein Minimum beschränkt, um eine Kontamination mit Plattenepithelzellen vor dem Aufschwimmen zu vermeiden.

  Die Objektträger werden nicht auf Sauberkeit geprüft. Solange die Schnitte während der Färbung auf dem Objektträger haften bleiben, geht man davon aus, dass sie sauber genug waren. Staub, Mikroorganismen und andere Verunreinigungen können sonst hervorragende Präparate verderben.

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A. Dieser Nierenschnitt beinhaltet schwarze Verunreinigungen, die sich vor dem Aufziehen auf dem Objektträger befanden. Auch in anderen Bereichen des Präparats waren derartige Verschmutzungen zu erkennen.
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B. In diesem Lungenschnitt sind gefärbte Klebstoffflecken zu finden, die sich bei der Schnitttrocknung gebildet hatten. Der Klebstoff, wahrscheinlich auf Gelatinebasis, stammt aus dem Wasserbad. Der Proteingehalt des Klebstoffs wurde durch die allmähliche Verdunstung des Wassers künstlich erhöht. Durch ordnungsgemäßes Abtropfen des Schnitts vor dem Trocknen hätte das Problem möglicherweise vermieden werden können.

Kreuzkontamination verhindern

  Die Wasseroberfläche wird zwischen verschiedenen Blöcken stets abgeschöpft, um eine Kontamination mit Zellen aus der vorherigen Probe zu vermeiden.

  Die Wasseroberfläche wird nicht konsequent abgeschöpft, bevor ein neuer Block bearbeitet wird. Dies kann zu einer Kontamination von einer Probe zur anderen führen und damit zu Verwirrung, Unsicherheit bei der Diagnosestellung und sogar zu falschen Ergebnissen.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
Dieser Herzmuskelschnitt wurde durch Fragmente von Schilddrüsengewebe aus einer anderen Probe kontaminiert. Diese Kontamination von einer Probe zur anderen ist im Wasserbad geschehen.

Kontamination durch Schuppen verhindern

  Während der Arbeit mit den Proben darf sich der Histologe nicht durch die Haare fahren oder die Hände reiben, um einer Verunreinigung durch Hautschuppen vorzugreifen.

  Es wird immer wieder beobachtet, dass Objektträger viele Schuppen enthalten. Das deutet daraufhin, dass die eigene Haut als Kontaminationsquelle nicht universell Beachtung findet.

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In diesem Nierenschnitt sind mehrere Schuppen zu erkennen, die sich auf der Oberfläche des Schnittes abgelagert haben, während er aufgezogen wurde. Sie haften fest und lassen sich durch Eosin anfärben.

Nicht von mehreren Blöcken aufziehen

  Es werden niemals Schnitte aus mehreren Blöcken bzw. Fällen gleichzeitig im Wasserbad gehandhabt.

  Man lässt Schnitte aus zwei oder mehr Blöcken bzw. Fällen gleichzeitig aufschwimmen. Das ist eine gefährliche Gewohnheit, die zur Verwechslung von Proben führen kann. Ein besonderes Risiko besteht, wenn die Schnitte zufällig vom gleichen Probentyp stammen.

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Hier werden Schnittbänder aus zwei verschiedenen Fällen gleichzeitig aufgezogen. Im Nachhinein kann es schwierig, mitunter gar unmöglich sein, einzelne Schnitte sicher zuzuordnen.

Wassertemperatur prüfen

  Die Temperatur des Wasserbads wird engmaschig überwacht. Eine Temperatur von 4-5 °C unter dem Schmelzpunkt des Wachses ist optimal. Die Schnitte sollen sich leicht glätten lassen, aber das Wachs darf nicht schmelzen.

  In Schnitten, die länger als 15 Sekunden im Wasserbad liegen, beginnt das Wachs zu schmelzen. Das mag den Eindruck erwecken, den Prozess des Aufschwimmens und Aufziehens zu beschleunigen, kann aber schnell zur übermäßigen Ausdehnung sowie zu Gewebe- und Zellschäden führen.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
Diese Hautschnitte zeigen deutliche Risse und eine unerwartete Trennung in Schichten, die typisch für eine thermisch begünstigte, zu starke Schnittdehnung ist. Ungenügend infiltriertes Gewebe ist sehr anfällig für dieses Problem.

Faltenbildung vermeiden

  Die Schnitte lassen sich im Wasserbad leicht glätten.

  Selbst nach dem Aufschwimmen im Wasserbad können die Schnitte nicht vollständig geglättet werden. Vielleicht ist das Wasser zu kalt; dann werfen die Schnitte beim Aufziehen Falten.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
In diesem Fall hat das Aufschwimmen nicht zur Glättung der Falten geführt, die bei der Schnitterstellung entstanden waren. Eine verbesserte Schneidetechnik und etwas wärmeres Wasser können helfen, dieses Problem zu beheben.

Übermäßige Ausdehnung der Schnitte vermeiden

  Die Schnitte werden gerade lange genug im Wasserbad belassen, um sie zu glätten, und dann sofort auf einen Objektträger aufgenommen.

  Der Einfachheit halber werden Schnitte zuweilen für längere Zeit im Wasserbad belassen. Dies kann zu einer übermäßigen Ausdehnung und Gewebeschädigung führen, insbesondere bei empfindlichen Proben wie lymphatischem Gewebe.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
A. Dieser Schnitt durch die Darmschleimhaut zeigt das Resultat einer zu starken Wärmeausdehnung: Betroffen ist die Lamina propria, wobei der große Abstand zu den Darmdrüsen zu beachten ist. Dieses Präparat wurde zu lange in einem zu heißen Wasserbad belassen. PAS-Färbung.
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B. Dieser Schnitt aus lymphatischem Gewebe ist während der Überdehnung im Wasserbad gerissen. Lymphatisches und hämatopoetisches Gewebe ist besonders anfällig für derartige Schäden.

Aufschwimmende Schnitte nicht beschädigen

  Wenn Falten mit einem Pinsel oder einer Pinzette entfernt werden sollen, geschieht dies mit äußerster Vorsicht, um Schäden an den schwimmenden Schnitten zu vermeiden.

  Schwimmende Schnitte werden schroff mit Pinzette oder Pinsel behandelt, um Falten zu glätten. Dabei werden den Präparaten makroskopische und mikroskopische Schäden zugefügt.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
In diesem Herzmuskelschnitt sind deutliche mechanische Schäden zu sehen, die beim Versuch, eine Falte zu entfernen, gesetzt wurden. Dabei wurde ein Gewebeabschnitt regelrecht herausgehebelt. H&E-Färbung.

Schnitte sorgfältig auswählen

  Die ersten ein oder zwei Schnitte eines Schnittbandes werden nicht auf Objektträger aufgezogen.

  Die ersten ein oder zwei Schnitte eines Schnittbandes werden für die weitere Bearbeitung und Auswertung genutzt, weil sie besser aussehen als die Folgeschnitte. Tatsächlich mögen sie diesen Eindruck erwecken, weil sie notwendigerweise dicker sind als die nächsten Schnitte. Das hängt mit der Ausdehnung des am Anfang besonders kalten Blocks zusammen.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
Die Schnitte in diesem Schnittband sind in der Reihenfolge nummeriert, in der sie erzeugt wurden. Beachten Sie, dass die ersten Schnitte breiter sind, also weniger komprimiert. Wenn sich der Block während der Mikrotomie erwärmt, werden die Schnitte anfälliger für übermäßige Kompression und damit schmaler. Ein weiterer Punkt, der zu beachten ist, ist die Schnittdicke. Obwohl das Mikrotom durchweg auf 3 μm eingestellt war, sind die ersten Schnitte aufgrund der thermischen Ausdehnung schätzungsweise 4-5 μm stark.

Blasenbildung und -einschluss vorbeugen

  Es wird darauf geachtet, dass sich im Wasserbad keine Luftblasen bilden. Alle erkennbaren Blasen werden entfernt, bevor die Schnitte auf die Wasseroberfläche gelegt werden.

  Kleine Luftblasen im Wasserbad werden ignoriert. Man geht davon aus, dass sämtliche Blasen, die unter Schnitten eingeschlossen werden, bei der Trocknung verschwinden. Das mag in der Tat so aussehen. Nichtsdestotrotz stellen sich jene Gewebeschnitte, die über den Luftblasen liegen, oft verzerrt dar und heben sich beim Färben wahrscheinlich noch weiter ab.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
Der kreisförmige, rissige Bereich in diesem Leberschnitt hat sich vom Objektträger abgehoben. Die Ursache war eine Luftblase, die während des Aufschwimmens unter den Schnitt geraten ist und ein ordnungsgemäßes Abflachen und Anhaften verhinderte. H&E-Färbung.

Abheben der Schnitte vom Objektträger verhindern

  Die Verwendung von adhäsiven, positiv geladenen Objektträgern oder Haftstoffen wie Aminoalkylsilan (AAS) wird in Betracht gezogen. Bei Bedarf kommen diese Produkte zum Einsatz.

  Manchmal schwimmen die Schnitte während der Färbung ab, insbesondere bei der Antigendemaskierung für die Immunhistochemie oder beim Einsatz von Methoden, die eine Wärmebehandlung erfordern. In diesen Fällen wären geladene Objektträger oder Haftstoffe die bessere Wahl.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
Ein Teil dieses Lungenpräparats hat sich vom Objektträger abgehoben und auf anliegendes Gewebe gelegt, das damit kaum mehr zu beurteilen ist. H&E-Färbung.

Vor dem Trocknen abtropfen lassen

  Die Schnitte werden kurz abgetropft, bevor sie in den Objektträgertrockner oder auf die Heizplatte gelegt werden.

  Das Wasser kann kaum von den Schnitten ablaufen, bevor diese horizontal positioniert und getrocknet werden. Die Schnitte schwimmen regelrecht auf dem Objektträger und trocknen nicht immer flach ab.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
A. Dieser Schnitt wurde horizontal getrocknet, ohne dass er vorher ausreichend abgetropft ist. Der unscharfe Bereich in der Mitte des Bildes ist das Ergebnis dieses Vorgehens
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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
B. Dieser Schnitt wurde soeben nach dem Aufschwimmen auf den Objektträger aufgezogen und wird für kurze Zeit zum Abtropfen vertikal aufgestellt, bevor er in den Objektträgertrockner gelegt wird. Dadurch lässt sich das in A gezeigte Problem vermeiden.

Trocknungstemperatur überwachen

  Die Temperatur des Objektträgertrockners wird sorgfältig überwacht.

  Der Objektträgertrockner kann schon mal zu heiß werden. Übermäßige Hitze kann zu Brennpunkten im Schnitt und zu Unregelmäßigkeiten in der Färbung führen.

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Einführung in die Mikrotomie: Vorbereitung & Schneiden Paraffin-eingebetteter Gewebe
Dieses Prostatapräparat zeigt das Ergebnis einer „Zellkernschmelze“. Als wahrscheinlichste Ursache kommt zu große Hitze beim Trocknen der Objektträger infrage. Fehler bei der Gewebeinfiltration können einen ähnlichen Effekt ergeben. Die Zellkernschmelze ist typischerweise am Rand der Proben zu erkennen und betrifft in den meisten Fällen Epithelgewebe. Die betroffenen Kerne sind ungleichmäßig gefärbt, manchmal rosa, manchmal blau, und morphologische Details gehen verloren.

Angemessene Trocknungszeit wählen

  Die minimale und maximale Trocknungszeit der Objektträger wird eingehalten.

  Die Trocknungszeiten der Objektträger variieren erheblich. Längeres Trocknen bei höheren Temperaturen wirkt sich nachteilig auf die Schnittqualität aus.

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Dry for Appropriate Time
Dieser Lymphknotenschnitt wurde zu lange und bei zu hoher Temperatur getrocknet und weist zahlreiche Risse auf. Solche Risse können auch durch andere Fehler in der Präparaterstellung verursacht werden, u. a. durch eine Überinfiltration. H&E-Färbung.

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About the presenter

Geoffrey Rolls, BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.