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Eine Einführung in Routine‑ und Spezialfärbungen

Routinefärbungen, allen voran die H&E-Färbung, und Spezialfärbungen spielen in der gewebebasierten Diagnostik und Forschung eine bedeutende Rolle. Durch die selektive Färbung ansonsten transparenter Strukturen ermöglichen sie die Betrachtung und Beurteilung unterschiedlichster Zellen und Gewebe. Qualifizierte Pathologen und Forscher bewerten die morphologischen Eigenschaften dieser Elemente, aus denen sie funktionelle Charakteristika ableiten und auf denen viele Klassifizierungen beruhen, und erkennen auch Störfaktoren wie Pathogene.

Im histopathologischen Labor bezieht sich der Begriff „Routinefärbung“ in aller Regel auf die Hämatoxylin-Eosin-Färbung, kurz H&E. Es ist eben diese Färbung, die routinemäßig auf nahezu alle Gewebeproben angewendet wird, um grundlegende Erkenntnisse zu deren Struktur zu erlangen. Von Spezialfärbungen hingegen ist die Rede, wenn alternative Färbemethoden erforderlich werden, weil die H&E-Färbung nicht alle Informationen liefert, die der Pathologe oder Forscher braucht. Dabei umfasst der Begriff eine große Anzahl verschiedener Färbetechniken.

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Warum die H&E-Färbung routinemäßig Anwendung findet

Die H&E-Färbung wird in histopathologischen Labors routinemäßig durchgeführt, da sie dem Pathologen bzw. Forscher eine sehr detaillierte Darstellung des Gewebes ermöglicht. Diese detaillierte Darstellung beruht auf einer klaren und deutlichen Anfärbung von extra- und intrazellulären Elementen einschließlich des Zytoplasmas, des Zellkerns und der Organellen. Die daraus abzuleitenden Informationen reichen oft aus, um eine Diagnose zu stellen, insbesondere wenn diese auf der räumlichen Organisation (oder Desorganisation) der Zellen beruht oder auf Anomalien, die in der H&E-Färbung gut erkennbar sind, z. B. bei pathologischen Veränderungen im Nukleus von Krebszellen. Trotz aller Fortschritte in den Färbetechniken ist die H&E-Färbung nach wie vor das Fundament der histopathologischen Diagnostik. Tatsächlich werden aufwendigere, weniger häufig angewendete Färbungen oft im Zusammenhang mit der H&E-Färbung interpretiert.

Im klinischen Labor werden deshalb nahezu alle Proben zunächst mit H&E gefärbt und Spezialfärbungen werden nur dann in Auftrag gegeben, wenn zusätzliche Informationen benötigt werden, um eine detailliertere Analyse zu liefern. Das ist etwa dann der Fall, wenn zwei morphologisch ähnliche Krebsarten unterschieden werden sollen.

Aufgrund des hohen Durchsatzes von H&E-Färbungen setzen die meisten Labore auf vollautomatische Systeme, um diese Aufgabe zu stemmen. Manuelle H&E-Färbungen sieht man nur noch selten.

Abbildung 2: Dieser Schnitt durch die Dünndarmschleimhaut zeigt gut definiertes Heterochromatin und Nukleoli in Epithelzellen und Plasmazellen innerhalb der Lamina propria.
Dieser Schnitt durch die Dünndarmschleimhaut zeigt gut definiertes Heterochromatin und Nukleoli in Epithelzellen und Plasmazellen innerhalb der Lamina propria.
Abbildung 3: Die mitotischen Figuren im Drüsenepithel dieses Dünndarmschnitts kommen sehr deutlich zum Tragen.
Die mitotischen Figuren im Drüsenepithel dieses Dünndarmschnitts kommen sehr deutlich zum Tragen.
Abbildung 4: In diesem Ausschnitt aus der Lamina propria des Dünndarms ist das Zytoplasma der Plasmazellen zu großen Teilen mit Hämatoxylin gefärbt. Die blasseren perinukleären Bereiche entsprechen einem gut entwickelten Golgi-Apparat.
In diesem Ausschnitt aus der Lamina propria des Dünndarms ist das Zytoplasma der Plasmazellen zu großen Teilen mit Hämatoxylin gefärbt. Die blasseren perinukleären Bereiche entsprechen einem gut entwickelten Golgi-Apparat.
Abbildung 5: In diesem autonomen Ganglion des zwischen der longitudinalen und zirkulären Muskulatur des Darmes gelegenen Plexus myentericus finden sich Neurone mit gut definierter, basophiler Nissl-Substanz im Zytoplasma, wobei diese Substanz aus endoplasmatischem Retikulum und Ribosomen besteht.
In diesem autonomen Ganglion des zwischen der longitudinalen und zirkulären Muskulatur des Darmes gelegenen Plexus myentericus finden sich Neurone mit gut definierter, basophiler Nissl-Substanz im Zytoplasma, wobei diese Substanz aus endoplasmatischem Re

Chemische Grundlagen der H&E-Färbung

Die H&E-Färbung umfasst den Einsatz zweier Farbstoffe: Hämatoxylin und Eosin. Diese Kombination empfiehlt sich, weil sich die beiden Farbstoffe in ihrer Affinität zu den einzelnen Gewebeelementen unterscheiden und deshalb verschiedene Strukturen anfärben.

Hämatoxylin ist ein basischer Farbstoff von blau-violetter Farbe. Es färbt saure (basophile) Strukturen an, einschließlich des Zellkerns mit seiner DNA und den Nukleoproteinen sowie Organellen, die RNA enthalten, darunter die Ribosomen und das raue endoplasmatische Retikulum.

Eosin hingegen ist ein saurer Farbstoff, der typischerweise rötlich oder rosa erscheint. Eosin bindet an basische (azidophile) Strukturen wie das Zytoplasma, die Zellwand und extrazelluläre Fasern.

Herkunft der Farbstoffe

Hämatoxylin wird aus dem Blutholzbaum extrahiert und dann aufgereinigt. Anschließend wird es oxidiert und mit einem Beizmittel versetzt, meist mit Aluminium, um seine Kapazität zur Bindung an Zellstrukturen zu erhöhen. Heute stehen zahlreiche Hämatoxylinzubereitungen zur Verfügung, von denen Gills Hämatoxylin, Harris Hämatoxylin und Mayers Hämatoxylin am häufigsten genutzt werden.

Eosin geht aus einer Reaktion zwischen Brom und Fluorescein hervor. Es gibt zwei Varianten dieses Farbstoffs, die regelmäßig in der Histologie verwendet werden: Eosin Y, das leicht gelblich ist, und Eosin B, dessen Farbe ins Bläuliche tendiert. Eosin Y ist das meistgebrauchte Eosin.

Abbildung 6: Strukturformel Hämatoxylin
Strukturformel Hämatoxylin
Abbildung 7: Strukturformel Eosin Y
Strukturformel Eosin Y

Special Stains

The term special stains traditionally referred to any staining other than an H&E. It covers a wide variety of methods that may be used to visualize particular tissue structures, elements, or even microorganisms not identified by H&E staining.

Other methods of staining use immunohistochemistry or in situ hybridization to target specific proteins or DNA/RNA sequences. These methods were sometimes also included as members of the “special stains” family. However they are quite different in method and purpose and are now typically separated into a third category know as “advanced stains”.

While there are literally hundreds of special stains for all manner of purposes, only a few are used with any regularity in clinical histology. The variety of stains also means that special staining is not as automated as H&E staining. While many larger laboratories do use automated instruments for the more common stains, they still have an area for hand staining. The complexity of some stains also works against the uses of automation.

Einige wichtige Spezialfärbungen

Die nachstehenden Bilder veranschaulichen die Wirkungen der häufigsten Spezialfärbungen und zeigen Beispiele für deren Anwendungsgebiete.

Abbildung 8: Masson-Trichrom-Färbung eines Hautschnitts. Diese Färbung ermöglicht die histologische Beurteilung von kollagenen Bindegewebsfasern in Gewebeproben. Weiterhin dient sie der Differenzierung von Kollagen und glatter Muskulatur in Tumoren und hilft bei der Erkennung pathologischer Veränderungen im Binde- und Muskelgewebe.
Die Masson-Trichrom-Färbung ermöglicht die histologische Beurteilung von kollagenen Bindegewebsfasern in Gewebeproben. Weiterhin dient sie der Differenzierung von Kollagen und glatter Muskulatur in Tumoren und hilft bei der Erkennung pathologischer Ver
Abbildung 9: Modifizierte Grocott-Methenamin-Silberfärbung, kurz GMS, (links: Pneumocystis, Lunge) (rechts: Aspergillus, Lunge). Die modifizierte GMS-Silberfärbung erlaubt die histologische Darstellung von Pilzen, Basalmembranen und einigen opportunistischen Erregern wie Pneumocystis jirovecii.
Die modifizierte GMS-Silberfärbung erlaubt die histologische Darstellung von Pilzen, Basalmembranen und einigen opportunistischen Erregern wie Pneumocystis jirovecii.
Abbildung 10: PAS-Färbung eines Nierenschnitts. Die PAS-Färbung oder Perjodsäure-Schiff-Reaktion wird hauptsächlich zur Färbung von kohlenhydratreichen Strukturen wie Glykogen, Glykoproteinen und Proteoglykanen verwendet, die vor allem in Bindegewebe, Mukus und Basalmembranen zu finden sind. Häufig genutzt wird sie zur Färbung von Nieren- und Leberbioptaten, zur Beurteilung der gestreiften Muskulatur von Patienten mit Verdacht auf Glykogenspeicherkrankheiten und zur Diagnose von Pilzinfektionen.
Die PAS-Färbung oder Perjodsäure-Schiff-Reaktion wird hauptsächlich zur Färbung von kohlenhydratreichen Strukturen wie Glykogen, Glykoproteinen und Proteoglykanen verwendet, die vor allem in Bindegewebe, Mukus und Basalmembranen zu finden sind. Häufi
Abbildung 11: Berliner-Blau-Färbung eines Leberschnitts. Diese Färbung ist auch als Eisennachweis nach Perls bekannt und wird zum Nachweis von dreiwertigen Eisenionen (Fe3+) in Gewebeproben, Blut- und Knochenmarkausstrichen verwendet. Unter physiologischen Bedingungen finden sich in Knochenmark und Milz geringste Mengen an Eisen in Form von Hämosiderin. Eine abnorme Erhöhung des Gehalts an Speichereisen kann auf Erkrankungen wie Hämochromatose und Hämosiderose hinweisen.
Die Berliner-Blau-Färbung ist auch als Eisennachweis nach Perls bekannt und wird zum Nachweis von dreiwertigen Eisenionen (Fe3+) in Gewebeproben, Blut- und Knochenmarkausstrichen verwendet. Unter physiologischen Bedingungen finden sich in Knochenmark und
Abbildung 12: Ziehl-Neelsen-Färbung säurefester Stäbchen in der Lunge. Mithilfe dieser Färbung lassen sich säurefeste Bakterien darstellen. Dabei handelt es sich um Erreger mit besonderer Zellwandstruktur, z. B. Mycobacterium und Nocardia. Ein wichtiges Einsatzgebiet für diese Färbung ist die Diagnose der Tuberkulose.
Färbungen für säurefeste Bakterien erlauben den Nachweis bakterieller Erreger mit besonderer Zellwandstruktur, z. B. Mycobacterium und Nocardia. Ein wichtiges Einsatzgebiet für diese Färbung ist die Diagnose der Tuberkulose sowie anderer bakterielle
Abbildung 13: Mit Alcianblau gefärbter Darmschnitt. Alcianblau wird normalerweise mit einem pH-Wert von 2,5 angesetzt und dient zum Nachweis saurer Mukopolysaccharide und saurer Muzine. In Mesotheliomen lassen sich vermehrt nicht sulfatierte Mukosubstanzen feststellen und in den Wänden der Blutgefäße weist eine erhöhte Konzentration derselben auf eine beginnende Atherosklerose hin, während im gesunden Gefäß nur geringe Mengen vorkommen.
Alcianblau wird normalerweise mit einem pH-Wert von 2,5 angesetzt und dient zum Nachweis saurer Mukopolysaccharide und saurer Muzine. Übermäßige Mengen an nicht sulfatierten sauren Mukosubstanzen treten bei Mesotheliomen auf. Eine gewisse Menge ist nor
Abbildung 14: Mit Alcianblau/PAS gefärbter Darmschnitt. Hier wird die Alcianblau-Färbung mit der PAS-Reaktion kombiniert, wodurch sich das Spektrum anzufärbender Elemente erweitert.
Die Kombination aus Alcianblau-Färbung und PAS-Reaktion ermöglicht eine Erweiterung des Spektrums anzufärbender Elemente.
Abbildung 15: Submukosa, die einer Gömöri-Trichrom-Färbung mit Anilinblau unterzogen wurde. Trichrom-Färbetechniken werden dazu eingesetzt, um Muskelfasern, Kollagen und Zellkerne anzufärben. Sie können auch zur Differenzierung von Skelettmuskulatur, Herzmuskelgewebe und glatten Muskelfasern verwendet werden. Die Gömöri-Trichrom-Färbung ist eine vereinfachte Version der aufwendigeren Masson-Trichrom-Färbung und kombiniert den Plasmafarbstoff Chromotrop 2R mit bindegewebsaffinen Farbstoffen wie Lichtgrün, Fast Green FCF oder Anilinblau, um ein leuchtendes, kontrastreiches Färbeergebnis zu erzielen.
Die Gömöri-Trichrom-Blaufärbung wird dazu eingesetzt, um Muskelfasern, Kollagen und Zellkerne anzufärben. Sie können auch zur Differenzierung von Skelettmuskulatur, Herzmuskelgewebe und glatten Muskelfasern verwendet werden. Die Gömöri-Trichrom-Fä
Abbildung 16: Submukosa, die einer Gömöri-Trichrom-Färbung mit grünem Farbstoff unterzogen wurde. Trichrom-Färbetechniken werden dazu eingesetzt, um Muskelfasern, Kollagen und Zellkerne anzufärben. Sie können auch zur Differenzierung von Skelettmuskulatur, Herzmuskelgewebe und glatten Muskelfasern verwendet werden. Die Gömöri-Trichrom-Färbung ist eine vereinfachte Version der aufwendigeren Masson-Trichrom-Färbung und kombiniert den Plasmafarbstoff Chromotrop 2R mit bindegewebsaffinen Farbstoffen wie Lichtgrün, Fast Green FCF oder Anilinblau, um ein leuchtendes, kontrastreiches Färbeergebnis zu erzielen.
Die Gömöri-Trichrom-Grünfärbung wird dazu eingesetzt, um Muskelfasern, Kollagen und Zellkerne anzufärben. Sie können auch zur Differenzierung von Skelettmuskulatur, Herzmuskelgewebe und glatten Muskelfasern verwendet werden. Die Gömöri-Trichrom-F
 

Schritte zu besseren Spezialfärbungen

Leica Biosystems versteht es als seine Mission, eine bessere Krebsdiagnostik und damit höhere Lebensqualität zu ermöglichen. Eine Möglichkeit zur Umsetzung dieser Mission ist die Verbesserung der Färbequalität. Wir wissen, dass die Qualität von IHC- und ISH-Färbungen nicht allein vom Färbemittel abhängt, und wollen in dieser Serie auf die unterschiedlichen Faktoren schauen, die die Färbequalität beeinflussen. Wir hoffen, damit einen Beitrag zu höherer Diagnosesicherheit zu leisten.

Die Färbung verstehen

Sie wissen, was Sie mit der Färbung, die Sie durchführen, zu zeigen versuchen.

Einem Protokoll zu folgen, ohne zu wissen, was im Schnitt zu sehen sein soll, führt selten zum Erfolg.

A Hier handelt es sich um einen PAS-gefärbten Leberschnitt. Lipofuszin und Glykogen sind PAS-positiv, während Spuren von Galle und Hämosiderin PAS-negativ sind und in ihren natürlichen Farben Gelb und Braun erscheinen. B Dieser Schnitt zeigt eine opportunistische Pilzinfektion der Lunge durch Aspergillus. Die Pilzhyphen stellen sich schwarz dar, ebenso wie ungefärbter Teer, der in den Lungen von Rauchern und den meisten Stadtbewohnern zu finden ist. Grocott-Färbung.
Die Färbung verstehen

Immer eine Positivkontrolle mitführen

In jedem Durchlauf wird eine Positivkontrolle mitgeführt, also ein Präparat, das sicher die Zielstrukturen enthält, die Sie zeigen bzw. anfärben möchten.

Wenn die Zielstruktur nicht dargestellt werden kann, wird angenommen, dass sie im Präparat nicht enthalten ist.

Dieser Schnitt durch eine zirrhotische Leber wurde einer Perl-Färbung unterzogen, um eisenhaltiges Hämosiderin zu zeigen, das sich blau darstellt. Der zugehörige Block eignet sich gut als Positivkontrolle für Eisenfärbungen.
Immer eine Positivkontrolle mitführen

Zeitliche Vorgaben einhalten

 Man hält sich an die zeitlichen Vorgaben im Protokoll.

Zeitliche Vorgaben werden nur ungefähr eingehalten. Ein solches Vorgehen führt zu ungefähren, d. h. inkonsistenten, nicht reproduzierbaren Ergebnissen.

Diese beiden Hautschnitte stammen aus demselben Block und wurden mit der PAS-Reaktion gefärbt. A wurde 5 Minuten lang mit dem Oxidationsmittel Perjodsäure behandelt, während Schnitt B diesem Agens nur 30 Sekunden lang ausgesetzt war, was eindeutig zu kurz ist. So lässt sich die äußerst schwache Färbung der Basalmembran in Schnitt B erklären.
Zeitliche Vorgaben einhalten

Stabilität der Reagenzien berücksichtigen

Man achtet auf die Haltbarkeit der Reagenzien, die verwendet werden sollen. Einige Reagenzien oder Farbstofflösungen zersetzen sich langsam, während andere sehr instabil sind, frisch angesetzt und sofort verwendet werden müssen. Wieder andere können erst mit einer gewissen Verzögerung benutzt werden, weil beispielsweise Oxidationsprozesse ablaufen müssen, bevor die Lösung einsatzbereit ist.

Man geht davon aus, dass sämtliche Reagenzien auf unbestimmte Zeit verwendet werden können.

Diese trübe, schlecht definierte Hämatoxylin-Färbung nach Weigert ist auf eine Überoxidation zurückzuführen. Beachten Sie die Braunfärbung des Kollagens.
Stabilität der Reagenzien berücksichtigen

Reagenzien ordnungsgemäß lagern

Sämtliche Reagenzien werden gemäß den Herstellerempfehlungen gelagert. Einige bedürfen einer dauerhaften Kühlung, weil sie sonst allzu leicht schimmeln oder andere Mikroorganismen in ihnen wachsen. Andere sind lichtempfindlich und müssen im Dunkeln gelagert werden.

 „Alle Reagenzien stehen griffbereit im Regal über der Färbebank. Nicht selten verderben sie dort.“

In diesem Schnitt sind zahlreiche Mikroorganismen zu erkennen, die in der Färbelösung gewachsen sind und mit dieser auf das Präparat übertragen wurden. In diesem Fall ging es um die Hämatoxylin-Lösung.
Reagenzien ordnungsgemäß lagern

Dem Protokoll folgen

Man folgt dem Protokoll in allen seinen Schritten.

Mitarbeiter erzielen unterschiedliche Ergebnisse, obwohl sie vermeintlich dem gleichen Protokoll folgen.

Diese Schnitte durch Formalin-fixierte intestinale Submukosa wurden einer Masson-Trichrom-Färbung unterzogen. In Schnitt A stellt sich die glatte Muskulatur rot dar. In diesem Fall wurde die Färbung korrekt nach Protokoll durchgeführt, einschließlich einer vorbereitenden Behandlung mit Chromsäure zur Sensibilisierung. Dieser Schritt des Beizens mit Chromsäure wurde beim Färben von Schnitt B übergangen. Daraus resultiert die fehlende Differenzialfärbung der Muskulatur in diesem Präparat.
Dem Protokoll folgen

Abweichungen notieren

Jede Abweichung vom Protokoll wird unverzüglich festgehalten.

Wenn die Ergebnisse nicht den Erwartungen entsprechen, ist es manchmal schwierig oder gar unmöglich, herauszufinden, woran es gelegen haben könnte, weil Änderungen am Protokoll nicht konsequent notiert wurden.

In dieser Silberfärbung nach Gordon und Sweets stellen sich die argyrophilen Retikulinfasern nur schlecht dar. Außerdem befindet sich ein Präzipitat auf dem Objektträger, das als schaumiger Hintergrund imponiert und die Beurteilung des Nierengewebes weiter erschwert. Es ist sehr schwierig, die Ursache für derartige Probleme zu ermitteln, wenn die Methode nicht genau befolgt wurde.
Abweichungen notieren

Waschschritte standardisieren

Auch was die Waschschritte betrifft, hält man sich streng ans Protokoll. Bekanntermaßen sind sie eine häufige Ursache von unerwünschter Variabilität in den Ergebnissen, weshalb sie standardisiert werden müssen.

Man wendet unterschiedliche Waschtechniken an: Manche Mitarbeiter schütteln kräftig, andere schwenken sanft. Und dazwischen bleibt viel Platz für Variationen.

Diese Leberschnitte wurden nach der gleichen Methode gefärbt. Der einzige Unterschied zwischen den beiden Präparationen war die Technik, mit der sie zwischen Imprägnierung und Reduktion gespült wurden. Die retikulären Fasern stellen sich schwarz dar und sind im Schnitt A bedeutend besser definiert. Silberfärbung nach Gordon & Sweets.
Waschschritte standardisieren

Mikroskop für Qualitätskontrolle einstellen

Entscheidende Zwischenschritte, z. B. solche, die einer Differenzierung bedürfen, werden mikroskopisch kontrolliert. Dabei weiß der Anwender, wie sich die routinemäßigen Einstellungen des Mikroskops auf das Erscheinungsbild von nassen, noch nicht eingedeckten Schnitten auswirken. Ihm ist bewusst, wie er das Gerät einstellen muss, um nicht dem falschen Eindruck einer Hintergrundfärbung zu erliegen.

Der Grad der Färbung wird allein durch die Betrachtung des Objektträgers mit bloßem Auge beurteilt.

 

 

A: Nassschnitt (ohne Deckgläschen), betrachtet unter einem Mikroskop mit geschlossener Kondensorblende. Der Hintergrund erweckt den Eindruck, er wäre mitgefärbt. B: Nassschnitt (ohne Deckgläschen), betrachtet unter einem Mikroskop mit offener Kondensorblende. Hier ist der Hintergrund klar.
Mikroskop für Qualitätskontrolle einstellen

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