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Fixierung und Fixiermittel – Beliebte Fixierlösungen

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

In diesem vierten Teil der Serie „Fixierung und Fixiermittel“ sollen einige der gängigsten Fixierlösungen betrachtet werden, die sich in den vergangenen 100 Jahren ihren Platz in der Histologie gesichert haben. Dazu wird ein Überblick über kommerziell erhältliche Fixative gegeben und es werden Empfehlungen zur Auswahl des richtigen Fixiermittels für die jeweilige Anwendung ausgesprochen.

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Beliebte Fixierlösungen

Nachfolgend finden Sie Informationen zu einigen der weitverbreitetsten Fixiermittel. Klicken Sie auf den Namen des Fixativs, um direkt zum entsprechenden Abschnitt geleitet zu werden. Die Liste ist keinesfalls als vollständig zu verstehen, denn in den vergangenen 100 Jahren wurden buchstäblich Hunderte von Formulierungen zu Fixiermitteln und Fixiergemischen veröffentlicht. Für die Zusammenstellung der Liste wurden repräsentative Vertreter der großen Fixiermittelgruppen ausgewählt, die in vielen Laboren zum Einsatz kommen. Einige dieser Reagenzien können gebrauchsfertig von gewerblichen Anbietern erworben werden.1-4

  1. Phosphatgepuffertes Formalin
  2. Formalin mit Kalziumchlorid
  3. Saline Formalinlösung
  4. Formalin mit Zink (ungepuffert)
  5. Zenker-Lösung
  6. Helly‘sche Lösung
  7. Fixiermittel B5
  8. Bouin'sche Lösung
  9. Hollande-Lösung
  10. Gendre-Lösung
  11. Clarke-Lösung
  12. Carnoy-Lösung
  13. Methacarn
  14. Alkoholisches Formalin
  15. Alkohol-Formalin-Eisessig
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Fixierung und Fixiermittel – Beliebte Fixierlösungen
Abbildung 1: Ein kommerziell erhältliches Konzentrat, aus dem sich durch Verdünnung mit Wasser eine neutral gepufferte Formalinlösung herstellen lässt.

1. Phosphatgepuffertes Formalin

Formulierung

  • 100 ml Formaldehyd 40 %
  • 900 ml destilliertes Wasser
  • 4 g Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat
  • 6,5 g wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat
  • Die Lösung sollte einen pH-Wert von 6,8 haben.
  • Fixierungszeit: 12-24 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Hierbei handelt es sich um das am häufigsten verwendete Fixiermittel auf Formaldehydbasis für die routinemäßige Histopathologie. Der Puffer hilft, die Bildung von Formalinpigment zu vermeiden. Viele Epitope erfordern eine Antigendemaskierung, wenn eine immunhistochemische Untersuchung angeschlossen werden soll. Die meisten Pathologen fühlen sich sicher bei der Interpretation des morphologischen Bildes, das mit dieser Art von Fixiermittel produziert wird.

2. Formalin mit Kalziumchlorid

Formulierung

  • 100 ml Formaldehyd 40 %
  • 10 g Kalziumchlorid
  • 900 ml destilliertes Wasser
  •  Fixierungszeit: 12-24 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Dieses Fixiermittel wird für die Konservierung von Lipiden, insbesondere von Phospholipiden empfohlen.

3. Saline Formalinlösung

Formulierung

 

  • 100 ml Formaldehyd 40 %
  • 9 g Natriumchlorid
  • 900 ml destilliertes Wasser
  • Fixierungszeit: 12-24 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Dieses Gemisch aus Formaldehyd und isotoner Kochsalzlösung wurde vor der Einführung von phosphatgepuffertem Formalin regelmäßig für die routinemäßige Histopathologie verwendet. Ein Nachteil dieser Lösung ist die häufige Bildung von Formalinpigment.

4. Formalin mit Zink (ungepuffert)

Formulierung

  • 1 g Zinksulfat
  • 900 ml demineralisiertes Wasser
  • Rühren, bis aufgelöst, erst dann 100 ml Formaldehyd 40hinzufügen
  • Fixierungszeit: 4-8 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Zinkhaltige Formalinlösungen wurden als Alternativen zu jenen Fixativen entwickelt, die Quecksilberchlorid enthalten. Man schreibt ihnen einen positiven Effekt auf die Immunhistochemie zu. Es stehen verschiedene Varianten zur Verfügung, von denen einige Zinkchlorid enthalten, das vermutlich etwas korrosiver ist als Zinksulfat.

5. Zenker-Lösung

Formulierung

  • 950 ml destilliertes Wasser
  • 50 g Quecksilberchlorid
  • 25 g Kaliumdichromat
  • 50 ml Eisessig
  • Fixierungszeit: 4-24 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Mit diesem Fixiergemisch lassen sich die Zellkerne gut erhalten, aber der Essig in der Lösung verursacht eine Lyse der roten Blutkörperchen. Zenker-Lösung wurde für gestaute Proben empfohlen und liefert gute Ergebnisse in Verbindung mit ​Phosphorwolframsäure-Hämatoxylin und Trichrom-Färbungen. Dem Anwender sollte bewusst sein, dass während der Fixierung Quecksilberpigment ausfällt, das vor der Färbung von den Schnitten entfernt werden muss. Außerdem kann Chrompigment entstehen, wenn das Gewebe vor der Infiltration nicht in Wasser gewaschen wird. Die Proben sind recht intolerant gegenüber diesem Fixativ, weshalb sie nach dem Waschen in Ethanol 70 % überführt werden sollten.

6. Helly‘sche Lösung

Formulierung

  • 1000 ml destilliertes Wasser
  • 25 g Kaliumdichromat
  • 10 g Natriumsulfat
  • 50 g Quecksilberchlorid
  • Unmittelbar vor Gebrauch hinzuzufügen:
  • 50 ml Formaldehyd 40 %
  • Fixierungszeit: 4-24 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Helly‘sche Lösung eignet sich hervorragend für Knochenmark, extramedulläre Hämatopoese und die Glanzstreifen der Herzmuskulatur.

Ähnlich wie die Zenker-Lösung führt auch dieses Fixativ zur Bildung von Quecksilber- und möglicherweise von Chrompigment. Ersteres muss vor der Färbung ausgewaschen werden, letzteres lässt sich durch entsprechendes Waschen vermeiden. Weil das Gewebe Helly‘sche Lösung nur schlecht toleriert, sollte es nach den entsprechenden Waschschritten in Ethanol 70 % gegeben werden. Aufgrund des niedrigen pH-Werts dieser Lösung kann auch Formalinpigment entstehen.

7. Fixiermittel B5

Formulierung

Stammlösung

  • 12 g Quecksilberchlorid
  • 2,5 g wasserfreies Natriumacetat
  • 200 ml destilliertes Wasser

Arbeitslösung, unmittelbar vor Gebrauch ansetzen

  • 20 ml B5 Stammlösung
  • 2 ml Formaldehyd 40 %
  • Fixierungszeit: 4-8 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Trotz seines Quecksilbergehalts und der damit verbundenen Probleme bei der Entsorgung wird dieses Fixiermittel weiterhin gern für die Fixierung von hämatopoetischem und lymphatischem Gewebe verwendet. Es liefert präzise nukleäre Details und funktioniert ausgezeichnet mit Spezialfärbungen und immunhistochemischen Studien. Vor der Färbung müssen die Schnitte vom Quecksilberpigment befreit werden, dass sich bei der Behandlung mit B5 bildet. Gewebeproben sollten nicht in diesem Fixiermittel aufbewahrt, sondern stattdessen in Ethanol 70 % gegeben werden.

8. Bouin'sche Lösung

Formulierung

  • 750 ml gesättigte wässrige Pikrinsäurelösung (2,1 %)
  • 250 ml Formaldehyd 40 %
  • 50 ml Eisessig
  • Fixierungszeit: 4-18 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Die Fixierung mit Bouin‘scher Lösung empfiehlt sich für Gewebe, das anschließend einer Trichrom-Färbung unterzogen werden soll. Glykogen wird gut konserviert, aber die Erythrozyten werden meist lysiert. Manche Autoren befürworten den Einsatz dieses Fixiermittels für Biopsien aus dem Gastrointestinaltrakt, für endokrine Drüsen und tierische Embryonen. Auf die durch Pikrinsäure verursachte, leuchtend gelbe Färbung des Gewebes sei hingewiesen. Überschüssige Pikrinsäure sollte deshalb vor der Färbung mit Ethanol 70 % aus dem Gewebe gewaschen werden. Bouin'sche Lösung ist leicht sauer, weshalb sie im Laufe der Zeit sowohl Kalzium- als auch Eisenablagerungen auflöst.

9. Hollande-Lösung

Formulierung

  • 25 g Kupferacetat
  • 40 g Pikrinsäure
  • 100 ml Formaldehyd 40 %
  • 15 ml Essigsäure
  • 1000 ml destilliertes Wasser

 Lösen Sie die Reagenzien in destilliertem Wasser, ohne Wärme anzuwenden.

  •  Fixierungszeit: 4-18 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Dieses Fixiergemisch wird für Proben aus dem Gastrointestinaltrakt und Endokrinium verwendet. Die Lyse der roten Blutkörperchen ist weniger ausgeprägt als bei Verwendung Bouin‘scher Lösung, aber ähnlich wie diese hat auch Hollande-Lösung entkalkende Eigenschaften.

Hollande-Lösung muss ausgewaschen werden, wenn die Proben im Gewebeinfiltrationsautomaten durch phosphatgepuffertes Formalin laufen sollen, da sich sonst ein unlösliches Phosphatpräzipitat bildet.

10. Gendre-Lösung

Formulierung

  • 800 ml mit Pikrinsäure gesättigter Ethanol 95 %
  • 150 ml Formaldehyd 40 %
  • 50 ml Eisessig
  • Fixierungszeit: 4-18 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Hierbei handelt es sich um eine alkoholische Bouin‘sche Lösung, die effektiver zu werden scheint, wenn sie altert. Sie eignet sich hervorragend zur Konservierung von Glykogen und anderen Kohlenhydraten. Nach abgeschlossener Fixierung sollte das Gewebe in Ethanol 70 % gelegt werden. Eventuelle gelbe Farbreste sind vor der Färbung auszuwaschen.

11. Clarke-Lösung

Formulierung

  • 75 ml Ethanol absolut
  • 25 ml Eisessig
  • Fixierungszeit: 3-4 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Dieses Fixativ wurde für Gefrierschnitte und Ausstriche verwendet. Bei konventioneller Probenpräparation lassen sich mit Clarke-Lösung gute Ergebnisse erzielen, wenn die Fixierungszeit ausreichend kurz gehalten wird. Clarke-Lösung konserviert Nukleinsäuren, extrahiert aber Lipide. Aus der Fixierlösung können die Proben direkt in Ethanol 95 % übertragen werden.

12. Carnoy-Lösung

Formulierung

  • 60 ml Ethanol absolut
  • 30 ml Chloroform
  • 10 ml Eisessig
  • Fixierungszeit: 1-4 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Carnoy-Lösung wirkt schnell und liefert eine gute Zellkern- und Glykogenkonservierung. Während Erythrozyten lysiert und Lipide gelöst werden, kann ein zu langer Verbleib der Proben in diesem Fixativ zu einer übermäßigen Verhärtung und Schrumpfung führen.

13. Methacarn

Formulierung

  • 60 ml Methanol absolut
  • 30 ml Chloroform
  • 10 ml Eisessig
  • Fixierungszeit: 1-4 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Methacarn verhält sich ähnlich wie Carnoy-Lösung, verursacht aber weniger Gewebeverhärtung und -schrumpfung.

14. Alkoholisches Formalin

Formulierung

  • 100 ml Formaldehyd 40 %
  • 900 ml Ethanol 95 %
  • 0,5 g Calciumacetat kann hinzugefügt werden, um Neutralität zu gewährleisten
  • Fixierungszeit: 12-24 Stunden

Empfohlene Anwendungen

In dieser Formulierung werden ein denaturierendes und ein vernetzendes Fixiermittel kombiniert. Manchmal kommt alkoholisches Formalin in Vorbereitung auf die Infiltration zum Einsatz, insbesondere wenn eine unvollständige primäre Formalinfixierung abgeschlossen werden soll. Außerdem kann dieses Gemisch zur Fixierung oder Nachfixierung von großen, fetthaltigen Proben, insbesondere Brustgewebe, verwendet werden. Unter alkoholischem Formalin wird das Fett extrahiert, was die Identifikation der Lymphknoten vereinfacht. Falls es zur Primärfixation angewandt wird, können die Proben anschließend direkt in Ethanol 95 % überführt werden.

15. Alkohol-Formalin-Eisessig

Formulierung

  • 85 ml Ethanol absolut
  • 10 ml Formaldehyd 40 %
  • 5 ml Eisessig
  • Fixierungszeit: 1-6 Stunden

Empfohlene Anwendungen

Hier handelt es sich um ein Fixiergemisch, das aufgrund seines Essigsäuregehalts noch schneller wirkt als alkoholisches Formalin, aber auch die Bildung von Formalinpigment induzieren kann. Anwendung findet es beispielsweise bei der Gefrierschnittfixierung. Ähnlich wie beim alkoholischen Formalin gilt auch hier, dass ein direkter Übertrag in Ethanol 95 % möglich ist, wenn das Gemisch zur Primärfixierung verwendet wird.

Kommerziell erhältliche Fixierlösungen

In den letzten Jahren hat die Anzahl kommerziell erhältlicher Fixiermittel, die für verschiedene Anwendungen in der Histopathologie und der medizinischen Forschung empfohlen werden, stark zugenommen. Oft werden sie als weniger toxischer Ersatz für traditionelle Fixative auf Formalinbasis oder gar quecksilberhaltige Lösungen wie B5 beworben.

Obwohl ein Sicherheitsdatenblatt zur Verfügung gestellt werden muss, wird die genaue Zusammensetzung dieser Reagenzien meist nicht veröffentlicht und der potenzielle Anwender muss sich mit der allgemeinen Beschreibung der Lösung begnügen. Diejenigen, die als Ersatz für B5 oder Zenker-Lösung vermarktet werden, die ihrerseits häufig zur Fixierung von lymphoidem und hämopoetischem Gewebe Anwendung finden, enthalten meist Zink- oder Bariumsalze und einen geringen Anteil an Formaldehyd. Direkter Formalinersatz hingegen wird in der Regel mit Glyoxal und anderen Komponenten hergestellt. Unter den Formalinersatzlösungen finden sich auch jene Fixative, die zur mikrowellengestützten Fixierung empfohlen werden (siehe Teil 5). In einigen dieser Formulierungen sind Ethanol, Methanol und Isopropanol enthalten.5

 

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Abbildung 2: Zwei Beispiele für kommerziell erhältliche Fixierlösungen. Dem Hersteller zufolge empfiehlt sich „Fix-All“, das Alkohol, Bariumchlorid und Formalin 10 % enthält, für die Fixierung aller Arten von Gewebe und als Ersatz für das quecksilberhaltige B5. „O-Fix“ enthält Alkohol, Formalin und Essigsäure und kann ebenso zur Fixierung aller Arten von Gewebe verwendet werden, wird jedoch besonders zur Markierung von Lymphknoten während der Dissektion empfohlen.

Welches Fixiermittel sollte ich verwenden?

In den meisten etablierten Labors hat man sich längst für ein Routinefixiermittel entschieden, dass seit längerer Zeit für die Mehrzahl der Proben verwendet wird. Pathologen, Histologen und Forscher, die diese Proben schließlich auswerten, sind an das morphologische Bild gewöhnt, das unter dem gewählten Fixiermittel und der nachfolgenden Verarbeitung erzeugt wird. Neutral gepuffertes Formalin ist nach wie vor das häufigste dieser Routinefixiermittel; andere Fixative werden für spezielle Gewebe genutzt, z. B. Zinkformalin für trepanierte Knochenmarkproben und andere Reagenzien für Nierenbiopsien und Gefrierschnitte. Gepuffertes Formalin ist so beliebt, weil es das wahrscheinlich flexibelste Fixiermittel ist. Es kann problemlos im geschlossenen Infiltrationsautomaten genutzt werden und verträgt sich mit den meisten Spezialfärbungen. Immunhistochemische Methoden, die im Allgemeinen eine Antigendemaskierung vorsehen, wurden für formalinfixiertes Gewebe optimiert, und Gewebeproben können für längere Zeit in Formalin gelagert werden, ohne wesentlichen Schaden zu nehmen. Molekulare Techniken wie die In-situ-Hybridisierung wurden ebenfalls für die Anwendung auf formalinfixiertem Gewebe validiert. Jedes neues Fixiermittel muss sich an dieser Flexibilität messen lassen.5-6

Bei aller Flexibilität halten zahlreiche Labore Ausschau nach Möglichkeiten zum Formalinersatz. Man möchte weniger toxische Reagenzien verwenden und in den vorherigen Absätzen sind dazu mehrere Alternativen beschrieben. In der Forschung, insbesondere wenn der Fokus auf einem ganz bestimmten Gewebetyp liegt, wird der Fixierung oft mehr Aufmerksamkeit und Mühe gewidmet. Dann ist es lohnenswert und machbar, mehrere Reagenzien zu testen, bevor eine endgültige Entscheidung getroffen wird. Wenn Sie einen Wechsel des Fixiermittels in Betracht ziehen, denken Sie nicht nur an das, was Sie unter dem Mikroskop sehen wollen, sondern berücksichtigen Sie auch die folgenden Punkte:

  • Toxizität des Fixiermittels, sowohl kurzfristig als auch kumulativ
  • Volatilität seiner Komponenten und die Ausstattung des Labors, mit der eine Exposition des Personals gegenüber potenziell gefährlichen Substanzen verhindert werden kann
  • Entzündbarkeit
  • Toleranz des Gewebes gegenüber dem Fixativ und Wirkung einer möglichen Überfixierung
  • Anforderungen an die Aufbewahrung der Proben, wenn diese nicht im Fixiermittel belassen werden können
  • Kompatibilität des Fixiermittels mit dem Gewebeinfiltrationsautomaten und Potenzial zur Beschädigung seiner Teile
  • Praktische und rechtliche Anforderungen an die Entsorgung

 

Der Wechsel zu einem anderen Fixiermittel erfordert sorgfältiges Abwägen und eine gründliche Bewertung.

 

Referenzen

  1. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol 2001;24;173 -190.
  2. Leong AS-Y. Fixation and fixatives. In Woods AE und Ellis RC eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.1-1 - 4.1-26.
  3. Hopwood D. Fixation and fixatives. In Bancroft JD and Stevens A eds. Theory and practice of histological techniques. New York: Churchill Livingstone, 1996.
  4. Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 2007.
  5. Titford ME, Horenstein MG. Histomorphologic Assessment of Formalin Substitute Fixatives for Diagnostic Surgical Pathology. Arch Pathol Lab Med 2005;129;502-506.
  6. Kothmaier H, Rohrer D, Stacher E, Quehenberger F, Becker K-F, Popper HH. Comparison of Formalin-Free Tissue Fixatives: A Proteomic Study Testing Their Application for Routine Pathology and Research. Arch Pathol Lab Med 2011;135;744-752.

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About the presenter

Geoffrey Rolls, BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.