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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Microtomía y preparación de los cortes en parafina

La creación de grandes secciones de parafina con un micrótomo de rotación requiere mucha habilidad y experiencia. "Microtomía y preparación de la sección en parafina" es un recurso formativo de gran ayuda para nuevos microtomistas y un excelente material de repaso para técnicos ya experimentados. Se cubren todos los aspectos esenciales del corte de secciones de parafina, incluidos los siguientes:

  • Seguridad
  • Configuración del micrótomo
  • Cuchillas para microtomo
  • Recorte y desbastado de bloques
  • Técnicas para cortes de parafina uniformes
  • Mantenimiento del micrótomo
  • Errores comunes de microtomía
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Pasos para mejorar la microtomía + flotación + secado de cortes

Desde el paciente hasta el patólogo, la preparación de muestras de tejidos para su examen histológico requiere cuidado, habilidad y un procedimiento delicado. Esta guía proporciona asesoramiento práctico sobre las mejores técnicas, así como formas sencillas de evitar errores comunes.

En esta guía se ofrecen consejos para una mejor microtomía, flotación y secado de secciones. Esperamos que cada paso proporcione un valioso recordatorio de buenas prácticas histológicas y ayude a solucionar problemas cuando se produzcan resultados inaceptables.

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Usar cuchillas de alta calidad

Siempre se utilizan cuchillas afiladas de alta calidad para cortar.

Se utilizan las cuchillas durante el mayor tiempo posible; algunas “estrías lineales” se consideran aceptables.

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Usar cuchillas de alta calidad
A. Sección de bazo (H&E) que muestra muchas líneas finas debido a una cuchilla defectuosa.
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Usar cuchillas de alta calidad
B. Secciones de piel sometidas a flotación. Se puede ver una línea de cuchilla profunda que atraviesa directamente el tejido. Los defectos como este se pueden ver fácilmente durante la flotación.

Optimizar el ángulo de inclinación de la cuchilla

Siempre se optimiza el ángulo de inclinación de la cuchilla para cada tipo de microtomo y de cuchilla.

El ángulo de inclinación de la cuchilla no se ajusta cuando cambian las condiciones (diferente microtomo, nuevo tipo de cuchilla, diferente parafina, etc.).

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Optimizar el ángulo de inclinación de la cuchilla
Esta cinta corta de secciones cortada de un bloque frío muestra una compresión considerable (30-40 %). En este caso, la reconfiguración del ángulo de inclinación de la cuchilla superó el problema.

Recortar los bloques con cuidado

Los bloques se recortan con cuidado para exponer el tejido. Las últimas secciones siempre se cortan con el que será el espesor final para pulir la cara del bloque.

Los bloques se recortan bruscamente para ahorrar tiempo. La superficie no se pule antes de tomar las secciones finales. Esto a menudo produce un aspecto de “apolillado” en la sección final que está llena de pequeños orificios irregulares.

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Recortar los bloques con cuidado
La exposición inicial del tejido (desbaste) en este bloque ha extraído fragmentos de la superficie del bloque, lo que ha dado lugar a numerosos orificios en la sección final (H&E).

Evitar daños por congelación

Los bloques se enfrían en una superficie húmeda y fría y siempre están fríos cuando se cortan (la superficie de hielo derritiéndose es excelente).

Los bloques se congelan antes de cortarlos. Esto a veces hace que los bloques se agrieten.

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Evitar daños por congelación
Esta cara del bloque se ha agrietado porque se congeló a 15 °C en un congelador antes del corte. Las grietas pueden dificultar el corte y la flotación porque la parafina ya no está unida al tejido.

Usar bloques fríos

Los bloques siempre están fríos cuando se cortan.

A veces hay un retraso antes de que las secciones finales se corten de un bloque. El bloque puede estar caliente y esto puede provocar una compresión excesiva de las secciones.

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Usar bloques fríos
A. La distorsión de los glomérulos en esta sección de un riñón se debe a una compresión excesiva cuando se corta la sección (H&E).
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Usar bloques fríos
B. Secciones del mismo bloque sometidas a flotación. Las secciones de la izquierda se cortaron sin enfriar el bloque, mientras que las de la derecha se cortaron cuando el bloque estaba frío.

Cortar las secciones lentamente

Las secciones finales de cada bloque se cortan con cuidado con un giro uniforme y lento.

Las secciones se cortan lo más rápido posible con un giro rápido, creyendo que “se superará cualquier compresión de sección en el baño de flotación”.

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Cortar las secciones lentamente
A. Hígado de roedor (tinción con reticulina) que muestra una fina rugosidad debido al corte demasiado rápido de un bloque frío de tejido quebradizo. En este caso, el problema se superó dejando que el bloque se calentara ligeramente y, a continuación, cortando muy lentamente. También puede producirse rugosidad si el bloque de parafina o la cuchilla no están bien sujetos en el microtomo.
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Cortar las secciones lentamente
B. Esta sección teñida con H&E de tejido mucoso muestra una fina rugosidad debido al corte muy rápido de un bloque muy frío.

Usar agua limpia

El agua del baño de flotación se sustituye periódicamente.

El agua del baño de flotación se rellena periódicamente, pero se sustituye solo ocasionalmente. Cualquier contaminante que haya en el baño puede acabar en la preparación debajo de la sección (hongos, moho, etc.)

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
Sección de serosa del tubo digestivo (H&E). Hay grupos de microorganismos débilmente teñidos presentes en el tejido, pero también pueden verse en la preparación, fuera de la sección. La fuente probable de estos organismos contaminantes fue el baño de flotación.

Asegurarse de que las preparaciones estén limpias

Siempre se comprueba la limpieza de las preparaciones antes de utilizarlas. La manipulación de las preparaciones es mínima para evitar la contaminación con células escamosas antes de la flotación.

No se comprueba la limpieza de las preparaciones: “Siempre que las secciones permanezcan en la preparación durante la tinción, consideramos que son satisfactorias”. El polvo, los organismos y otros contaminantes pueden estropear una preparación que de otro modo sería buena.

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Asegurarse de que las preparaciones estén limpias
A. Esta sección del riñón está estropeada por un contaminante negro que estaba presente en la preparación antes de su uso. El depósito podría verse debajo de la sección en otras partes de la preparación.
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Asegurarse de que las preparaciones estén limpias
B. Una sección de pulmón que contiene “grupos” adhesivos teñidos que se han formado cuando la sección se secó. El adhesivo (probablemente a base de gelatina) estaba presente en el baño de flotación. El contenido proteico del adhesivo se ha concentrado a medida que el agua se ha evaporado. El drenaje adecuado de la sección antes del secado podría haber evitado el problema.

Evitar la contaminación cruzada

Siempre se quita la espuma de la superficie del agua entre las muestras para evitar la contaminación de una sección con células de otra.

No se quita la espuma de la superficie del agua entre cada bloque. Esto puede provocar contaminación de muestra a muestra, lo que puede causar confusión e incluso un diagnóstico inexacto.

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Evitar la contaminación cruzada
Una sección de músculo cardíaco se ha contaminado con un fragmento de tiroides de otro caso. Este ejemplo de transferencia de muestra a muestra se produjo en el baño de flotación.

Evitar la contaminación con escamas

Se debe tener cuidado de no cepillar el pelo o las manos mientras hay secciones flotando (las escamas pueden contaminar las secciones).

“Algunos de nuestros empleados producen preparaciones que contienen muchas escamas. Parecen no saber que esto se puede evitar”.

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Evitar la contaminación con escamas
Sección de riñón que contiene muchas escamas extrañas que se depositaron en la superficie de la sección mientras estaba en el baño de flotación. Se adhieren firmemente y posteriormente se tiñen con eosina.

No flotar entre varios bloques

Las secciones de más de un bloque (caso) nunca se ponen a flotar simultáneamente en el baño de agua.

A veces, las secciones de dos o más bloques (casos) se dejan flotando simultáneamente. Se trata de una práctica peligrosa que puede dar lugar a una identificación inexacta de las muestras. Existe un riesgo concreto cuando las secciones proceden del mismo tipo de muestra.

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No flotar entre varios bloques
Aquí las secciones de dos casos diferentes se encuentran flotando simultáneamente. Esta práctica puede provocar confusión y dar lugar a una identificación inexacta de las secciones.

Comprobar la temperatura del agua

La temperatura del baño de flotación se comprueba cuidadosamente. Una temperatura de 4-5 °C por debajo del punto de fusión de la parafina es óptima. Las secciones deben aplanarse rápidamente, pero la parafina no debe fundirse.

Si las secciones se dejan en el baño de flotación durante más de 15 segundos, la parafina se funde. Aunque parezca que esto hace que el proceso sea más rápido, puede provocar rápidamente una expansión excesiva y daño celular y en el tejido.

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Comprobar la temperatura del agua
Estas secciones de la piel muestran claramente grietas y una separación excesiva de las capas, los efectos típicos de la expansión excesiva. El tejido mal procesado es muy propenso a este problema.

Evitar las arrugas en las secciones

Las secciones se aplanan rápidamente en el baño de flotación.

Las secciones nunca se aplanan bastante en el baño de flotación. El baño puede estar demasiado frío y las secciones pueden permanecer arrugadas cuando se recogen en la preparación.

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Evitar las arrugas en las secciones
En este caso, la flotación no ha solucionado las arrugas producidas durante el corte de estas secciones. Una mejor técnica de corte y un agua ligeramente más caliente solucionarían este problema.

Evitar la expansión excesiva de las secciones

Las secciones se dejan en el baño de flotación durante el tiempo suficiente para que se aplanen y, a continuación, se recogen rápidamente en una preparación.

Por comodidad, algunas secciones se dejan durante largos períodos en el baño de flotación. Esto puede provocar una expansión excesiva y daño en el tejido (especialmente en muestras delicadas como el tejido linfoide).

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Evitar la expansión excesiva de las secciones
A. Esta sección de mucosa intestinal teñida con PAS muestra una lámina propia expandida en exceso (muestra una separación excesiva de las glándulas intestinales). En este caso, la sección estuvo flotando demasiado tiempo en un baño que estaba demasiado caliente.
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Evitar la expansión excesiva de las secciones
B. Sección de tejido linfoide que se ha agrietado debido a la expansión excesiva en el baño de flotación. Los tejidos linfoides y hematopoyéticos son especialmente propensos a sufrir daños de esta manera.

No dañar las secciones flotantes

Al eliminar mecánicamente las arrugas con un cepillo o unas pinzas, se tiene mucho cuidado para evitar dañar las secciones flotantes.

Las arrugas se eliminan enérgicamente de las secciones flotantes con un cepillo o unas pinzas. Este procedimiento puede provocar fácilmente daños macroscópicos y microscópicos.

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
Una sección de músculo cardíaco muestra daño mecánico (ranurado), provocado al intentar eliminar un pliegue en la sección (corazón, H&E).

Elegir las secciones con cuidado

La primera o dos primeras secciones de una cinta nunca se recogen en las preparaciones.

Se seleccionan la primera y segunda secciones de una cinta para el montaje porque tienen mejor aspecto que las secciones posteriores. Tienen mejor aspecto porque son siempre más gruesas debido a la expansión del bloque frío durante el primer par de pasadas a través de la cuchilla.

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
Las secciones de la cinta preparadas a partir de este bloque están numeradas en el orden en que se cortaron. Tenga en cuenta que el primer par de secciones son más anchas (menos comprimidas), pero a medida que el bloque se calienta, las secciones se estrechan (más comprimidas). Aunque el microtomo se ajustó en 3 μm, el primer par de secciones tendría un grosor de 4-5 μm debido a la dilatación por calor.

Evitar burbujas bajo las secciones

Se debe tener cuidado para evitar la formación de burbujas de aire en el baño de flotación. Las burbujas visibles se quitan antes de que las secciones se depositen en el agua.

Se ignoran las pequeñas burbujas de aire en el baño de flotación. Las burbujas que quedan atrapadas debajo de la sección aparentemente desaparecen a medida que la sección se seca. Aunque las burbujas aparentemente pueden desaparecer, las zonas de la sección por encima de la burbuja a menudo se distorsionan y es probable que dejen de flotar durante la tinción.

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
Sección del hígado teñida con H&E, que muestra una zona circular agrietada en la que la sección se ha levantado. La causa fue una burbuja que se alojaba debajo de la sección durante la flotación y que evitó el aplanado y la adherencia adecuados.

Evitar que la sección se levante

Se considera el uso de preparaciones “adhesivas” (cargadas) o adhesivos de sección, como AAS, y se utiliza de forma adecuada.

A veces, las secciones dejan de flotar durante la tinción (especialmente durante la recuperación de antígenos para IHC o cuando los métodos requieren el uso de calor). En estas circunstancias, se requieren preparaciones cargadas o adhesivos de sección.

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
Esta preparación muestra una zona en la que la sección se ha levantado y se ha depositado en el tejido adyacente (pulmón, H&E).

Drenar antes de secar

Las secciones se drenan brevemente antes de colocarlas en el secador de preparaciones o en una placa calefactora.

Las secciones no se drenan correctamente antes de secarse horizontalmente. Las secciones se mueven sobre la preparación y a veces no se secan en plano.

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
A. Esta sección se secó horizontalmente sin un drenaje preliminar eficaz. En consecuencia, hay una zona elevada desenfocada visible en el centro del campo.
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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
B. Esta sección se acaba de recoger del baño de flotación y se drenará verticalmente durante un breve periodo antes de colocarla en el secador de preparaciones. Esto evitará el problema mostrado en A.

Supervisar la temperatura de secado

La temperatura del secador de preparaciones se supervisa minuciosamente.

A veces, el secador de preparaciones está muy caliente. El calor excesivo puede producir puntos calientes en las secciones y provocar una   tinción irregular.

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
Esta sección de la próstata muestra las características de “fusión nuclear”, siendo una posible causa el calor excesivo al secar las preparaciones. Un procesamiento defectuoso del tejido puede producir un efecto similar. La fusión nuclear se observa normalmente en el perímetro de las muestras y suele afectar al tejido epitelial. Los núcleos muestran una tinción irregular, que a veces aparecen rosados o muy azulados y carecen completamente de detalles.

Secar durante el tiempo adecuado

Se supervisa el tiempo mínimo y máximo de secado de la preparación.

Los tiempos de secado de las preparaciones varían considerablemente. El secado prolongado a temperaturas más altas puede ser perjudicial para las secciones.

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Introducción a la microtomía: Preparación y corte de tejidos incluido en parafina
Sección del ganglio linfático con H&E que muestra un amplio agrietamiento debido a un secado prolongado a una temperatura demasiado alta. Un agrietamiento como este también puede deberse a otros factores, incluido el procesamiento excesivo.

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About the presenter

Geoffrey Rolls, BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.