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Tinciones especiales: ¿cuál, cómo y por qué? Parte III: Microorganismos: bacterias y hongos

Definir microorganismos

Los microorganismos son organismos vivos, lo que incluye bacterias, hongos, protozoos y virus. Son tan pequeños que requieren la ayuda de un microscopio para poder ser observados, a veces incluso se necesita un microscopio electrónico. Las bacterias, hongos y protozoos pueden identificarse y clasificarse con procedimientos histoquímicos, y los virus generalmente se identifican con procedimientos inmunohistoquímicos.

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Introducción a los microorganismos: bacterias

Los microorganismos consisten en microorganismos unicelulares de un tamaño de unos pocos micromilímetros. Estos tres son muy comunes para los seres humanos: mycobacterium tuberculosis, mycobacterium leprae y helicobacter pylori.

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

causa tuberculosis, es inmóvil y tiene forma de bastoncillo, y se caracteriza e identifica por una propiedad conocida como “acidorresistente”, lo que significa que una vez absorbido, el colorante utilizado para teñir los bacilos no debe eliminarse cuando se incube en un enjuague ácido. El método preferido de identificación es una tinción de AFB, denominada también tinción de bacterias acidorresistentes (BAAR en español)

El ácido micólico es el mecanismo responsable de la propiedad acidorresistente. Esta sustancia cerosa es producida por las paredes de las bacterias. Este ácido se une con las sustancias de las paredes celulares de las bacterias, haciéndolas resistentes a la decoloración del tratamiento con un alcohol ácido. Las opciones más comunes de las tinciones de AFB son carbol fucsina de Kinyouin o carbol fucsina de Ziehl-Neelsen. Las soluciones, los procedimientos y los resultados son similares para ambas.

Carbol fucsina de Kinyouin

El proceso

Los resultados

El protocolo

Los tiempos de incubación pueden variar según el fabricante

1.

Ponga las preparaciones en agua

2.

Carbol fucsina (temperatura ambiente)

Entre 30 y 60 min

3.

La aplicación de calor a 60 ºC puede acortar los tiempos de incubación

4.

Enjuague bien con agua corriente

5 min

5.

Alcohol ácido HCL al 1 % (alcohol al 70 %)

10 seg

6.

Enjuague bien con agua corriente

2 min

7.

Azul de metileno al color deseado

Entre 30 y 40 seg

8.

Enjuagar brevemente con agua corriente

15 seg

9.

Se deshidrata rápidamente con alcoholes

10.

Aclarar y montar

Resolución de problemas de la tinción de AFB:

Es muy importante enjuagar bien después de aplicar carbol fucsina para eliminar el exceso de solución. Asegúrese de que el nivel de agua cubre completamente toda la preparación. Los residuos de tinte pueden extenderse a través del tejido y ensuciar los resultados. La decoloración se producirá rápidamente. Incube en HCL/EtOH al 70 % hasta que la preparación en el portaobjetos de vidrio esté limpia y el tejido tenga un aspecto ligeramente rosado. Después de la decoloración, aclare en agua, lavándolo muy bien y asegurándose de no dejar ningún ácido/EtOH en la preparación. Con el azul de metileno, menos es más. Si realiza una tinción excesiva en esta contratinción, los bacilos BAAR (ácido alcohol resistentes, AFB en inglés) pueden enmascararse. Hay una línea fina entre demasiado azul de metileno y demasiado poco. Si hay demasiado, puede que no se lave fácilmente y acabe enmascarando los bacilos. Si hay muy poca cantidad, puede que se elimine todo durante el lavado y por tanto no deje contraste. El ensayo y el error y la experiencia son la mejor respuesta.

Como se indicó anteriormente, el azul de metileno se puede eliminar rápidamente con alcoholes, así que asegúrese de comenzar con el 100 % para la deshidratación y pase las preparaciones rápidamente a través de 2 cambios solo para eliminar el agua de estos.

MYCOBACTERIUM LEPRAE

produce lepra y tiene propiedades acidorresistentes similares a M. Tuberculosis, pero es mucho menos eficaz. La tinción preferida para la demostración es la de Fite-Faraco.

Fite-Faraco

El proceso

Los resultados

El protocolo

Los tiempos de incubación pueden variar según el fabricante.

1.

Secar las preparaciones en el horno

2.

Incubar en una mezcla 50/50 de xileno/aceite de cacahuete

15 min

3.

Repetir con una segunda mezcla 50/50

15 min

4.

Secar con papel secante, lavar con agua, repetir para eliminar el aceite

5 min

5.

Carbol fucsina de Fite (temperatura ambiente)

20 min

6.

Enjuague bien con agua corriente

7.

HCL al 1 %/Alcohol al 70 %

Entre 1 y 5 seg

8.

Enjuagar con agua corriente

9.

Azul de metileno

Entre 10 y 20 seg

10.

Enjuagar rápidamente con agua corriente

11.

Secar con papel secante, no colocar en alcoholes, aclarar y montar

Resolución de problemas de la tinción Fite-Faraco:

Si las preparaciones se colocan accidentalmente en xileno y alcoholes siguiendo un protocolo normal de desparafinado, realice dos preparaciones nuevas y vuelva a empezar. Para obtener los mejores resultados, siga las mismas directrices para carbol fucsina de Kinyouin.

HELICOBACTER PYLORI

tiene forma de espiral y está asociada a inflamación gástrica, úlceras pépticas y carcinoma gástrico. Tienen propiedades argirófilas y no pueden absorber ni reducir la plata. Las tinciones preferidas para la demostración son la tinción de Warthin Starry con plata o una de las muchas modificaciones, tinción Giemsa y procedimientos de inmunohistoquímica (los más sensibles).

Plata Warthin Starry

El proceso

Los resultados

El protocolo

Los tiempos de incubación pueden variar según las directrices del fabricante Nota: La tinción con plata Warthin Starry se utiliza para demostrar muchos microorganismos variados, no solo H. Pylori. Por este motivo, puede encontrar protocolos que difieran del protocolo específico para H. Pylori a continuación.

1.

Ponga las preparaciones en agua

2.

Enjuagar con agua desionizada

3.

Nitrato de plata del 0,5 % al 1 %, precalentado a 65 °C

3–5 min

4.

Desarrollador/solución reductora

1–5 min

• Colocar las preparaciones en un frasco Coplin que contenga solución

• Añadir el frasco Coplin al baño de agua precalentado a 65 °C

• Incubar hasta que la sección de tejido adquiera un color marrón/dorado

5.

Enjuagar con agua tibia

2–3 min

6.

Deshidratar en alcoholes absolutos

7.

Aclarar y montar

Resolución de problemas de la tinción de Warthin Starry con plata para H. Pylori

Resolución de problemas de la tinción de Warthin Starry con plata para H. Pylori:

La tinción de Warthin Starry puede ser difícil de dominar. Asegúrese de seguir todas las instrucciones del fabricante para la mezcla de soluciones. Use instrumental de vidrio limpio y agua desionizada cuando se solicite. Es importante precalentar un baño de agua para la plata y el revelador/reductor. La plata debe estar a 65 °C cuando se carguen las preparaciones. A medida que el revelador/reductor se calienta, el tejido comenzará a desarrollar un color marrón/dorado cuando el proceso haya casi terminado. La agitación en la solución de revelador/reductor creará una preparación con una tinción más uniforme.

Nota: El calentamiento por microondas puede sustituirse por el calentamiento por baño de agua. Los tiempos deben ajustarse.

Giemsa

Giemsa es una tinción policromática compuesta de tintes con diferentes tonalidades.

 

El proceso

Los resultados

El protocolo

          Los tiempos de incubación pueden variar según las directrices del fabricante

1.

Deshidratar con metanol al 95 %

2.

Solución de trabajo de Jenner

10 min

3.

Solución de trabajo de Giemsa

45 min

4.

Agua de ácido acético glacial al 1 %

10 seg

5.

Enjuague rápido con agua corriente

6.

Secar bien con papel secante, aclarar y montar

Resolución de problemas de Jenner-Giemsa para H. Pylori:

Jenner y Giemsa son dos soluciones muy inestables y deben prepararse de nuevo para cada uso. Filtre ambas antes de usarlas. El paso del ácido acético glacial es fundamental. Una tinción insuficiente provocará una diferenciación deficiente en las células. Una tinción excesiva eliminará la mayor parte de la tinción. Seque en vez de deshidratar mediante alcoholes, ya que, si no, todo el azul de h. Pylori se eliminará.

Una comparación de tres procedimientos para la demostración de H. Pylori.

WARTHIN STARRY
WARTHIN STARRY
GIEMSA
GIEMSA
IHC INMUNOHISTOQUÍMICA
IHC INMUNOHISTOQUÍMICA

Introducción a los microorganismos: hongos

Los hongos consisten en organismos monocelulares y multicelulares con distintos núcleos y paredes celulares. Tres hongos comunes que causan enfermedades en humanos son cryptococcus neoformans, histoplasma capsulatum y pneumocystis carinii.

CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

vive en el medio ambiente en todo el mundo y puede causar meningitis en los seres humanos. Las infecciones suelen producirse en personas inmunodeprimidas. Las cápsulas quedan claramente demostradas mediante la tinción con mucicarmina, así como por un procedimiento con plata metenamina (véase el proceso a continuación).

Mucicarmina

El proceso

Los resultados

El protocolo

    Los tiempos de incubación pueden variar según las directrices del fabricante.

1.

Pasar las preparaciones por agua

2.

Hematoxilina de Weigert de trabajo

5–10 min

3.

Enjuagar con agua corriente

4.

Solución de mucicarmina de trabajo

20–30 min

5.

Enjuagar con agua corriente

6.

Amarillo de metanil

1–3 min

7.

Enjuagar brevemente con agua corriente

8.

Deshidratar, aclarar y montar

Resolución de problemas de la tinción con mucicarmina:

Siga las instrucciones del fabricante para hacer que la mucicarmina funcione. Recuerde diluirla de acuerdo con las instrucciones y utilizar el agua adecuada para la dilución (destilada frente a agua corriente). Use solución de Wiegert fresca. Si su solución de Wiegert no es púrpura, sino más bien parduzca, significa que se ha descompuesto y sus núcleos no se teñirán correctamente. La solución de trabajo de Wiegert puede durar un día completo, pero normalmente no toda la noche.

HISTOPLASMA CAPSULATUM

provoca histoplasmosis. La infección se produce por la respiración de estas esporas, lo que provoca síntomas similares a los de la gripe. Si no se trata, puede diseminarse por todo el cuerpo y causar la muerte. Es más frecuente en pacientes inmunodeprimidos. Se puede mostrar mediante la tinción con plata de metenamina de Gomori.

PNEUMOCYSTIS CARINII

se clasificó previamente como protozoo, pero ahora se considera un hongo en base al ácido nucleico y el análisis bioquímico. Puede dar lugar a una neumonía mortal en pacientes inmunodeprimidos. Se puede mostrar mediante la tinción con plata de metenamina de Gomori.

Plata de metenamina de Gomori

La plata de metenamina de Gomori depende de unas células que tienen una propiedad argentafín. Puede reducir los iones de plata invisibles a plata metálica visible sin una ayuda externa y es opuesto a lo argirófilo, como se observa en H. Pylori.

 

El proceso

Los resultados

PNEUMOCYSTIS APARECE COMO BOLAS NEGRAS CON FONDO VERDE CLARO
PNEUMOCYSTIS APARECE COMO BOLAS NEGRAS CON FONDO VERDE CLARO
CRYPTOCOCCUS CON GMS
CRYPTOCOCCUS CON GMS
HISTOPLASMOSIS CON GMS
HISTOPLASMOSIS CON GMS

El protocolo

1.

Ponga las preparaciones en agua

2.

Oxidar en ácido crómico

10 min

3.

Enjuague bien con agua corriente

3 min

4.

Bisulfito sódico

1 min

5.

Enjuagar con agua corriente

6.

Incubar en solución de plata de metenamina a 60 ºC.

10–20 min

7.

El tiempo de incubación viene determinado por la velocidad de impregnación

8.

Enjuagar con agua desionizada

9.

Cloruro de oro

1–2 min

10.

Enjuagar con agua corriente

11.

Tiosulfato de sodio

1 min

12.

Enjuagar con agua corriente

13.

Contratinción en verde claro

30-40 seg

14.

Enjuagar rápidamente con agua corriente

15.

Deshidratar, aclarar y montar

Solución de problemas de la tinción Giemsa o de GMS:

El ácido crómico debe cambiarse con frecuencia para promover la oxidación completa y depende del número de preparaciones procesadas. Mantener el recipiente cerrado cuando no se esté utilizando. Los tiempos de impregnación (si se realizan manualmente) requieren cierto ensayo y error, dependiendo del método de calentamiento utilizado (baño de agua u horno microondas). No teñir en exceso con verde claro, ya que esto puede enmascarar el organismo que desea mostrar.

GMS para Pneumocystis

References

Bibliografía

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Shaikh, Dr. Imran, “Special Stains in Histopathology.” Kem Hospital, 2012

Ellis, Roy. IMVS Division of Pathology, The Queen Elizabeth Hospital, Woodville Road, South Australia

Wikipedia encyclopedia – Pneumocystis Carinii

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Dacie y Lewis, Practical Hematology, 12th edition, 2017

ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8173783 - The Identity of Pneumocystis Carinii

Sheehan/Hrapchak. “Theory and Practice of Histotechnology.” Microorganisms. 2nd edition, 13: 233-251

Derm101.com Ackerman, A. Bernard (2000)

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