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고정 및 고정제 (2) - 화학적 고정에 영향을 미치는 요소, 포름알데히드 및 글루타르알데히드

Geoffrey Rolls BAppSc, FAIMS

고정 및 고정제 시리즈 2편에서는 조직 고정의 속도와 효과에 영향을 미치는 요소들을 살펴보고 두 가지 대표적인 고정제, 포름알데히드(조직학)와 글루타르알데히드(초미세 전자 현미경학)에 대해 알아봅니다.

화학적 고정에 영향을 미치는 요소

조직 고정의 속도와 효과에 영향을 미치는 요소는 여러가지가 있습니다.

온도: 고정 온도를 높이면 고정제의 조직 내 확산 속도가 빨라지고 고정제와 조직 요소간 화학적 반응을 가속화합니다. 이는 고정되지 않은 표본 부위의 조직 퇴화 속도도 높일 수 있습니다. 광학현미경 검사의 경우 초기 고정은 실온에서 이루어지며, 조직 처리 과정에서의 추가 고정은 최대 45°C에서 시행할 수 있습니다. 이는 좋은 품질의 형태학적 조직을 보존하기 위한 현재 가장보편화된 방법입니다. 극초단파 고정은 최대 65°C까지의 고온에서 시행 가능하지만 짧은 시간 내에 이루어져야 합니다. 자세한 내용은 5부를 참조하세요.

시간: 최적의 고정 시간은 고정제마다 다릅니다. 고정이 이루어지려면 고정제는 검체 중앙까지 확산 및 침투해야 하며 이후 고정 반응이 일어나도록 충분한 시간을 두고 기다려야 합니다. 확산시간과 반응 시간 모두 사용한 시약에 따라 달라지며 최적의 시간은 고정제마다 다릅니다. 분주한 진단 실험실에서는 처리 시간 단축의 압박이 크기 때문에 조직이 불완전하게 고정된 채 처리되는 결과가 발생할 수 있습니다. 이처럼 고정이 미흡한 조직은 처리가 잘 안 되기 때문에 조직이 왜곡되고 염색이 불량한 절편이 나올 수 있습니다. 처리 과정에서 불완전하게 고정된 조직을포르말린에서 빼내 에탄올에 넣으면, 에탄올은 조직을 계속해서 고정할 것이고 에탄올 고정에 따라 검체 중앙의 형태가 결정된다는 점을 유념해야 합니다.

침투율: 고정제의 침투율은 확산 특성에 따라 다르며 쓰는 고정제마다 달라집니다. Medawar는 이를 d = K√t 라는 수식으로 표현했는데, 여기서 d는 침투의 깊이, K는 확산 계수(고정제마다 다름),그리고 t는 시간을 가리킵니다. 1 여기서 확산 계수(K)는 한 시간에 고정제가 조직으로 확산해 이동한 거리를 밀리미터로 계산한 값입니다. 10% 포르말린, K = 0.78. 이는 포르말린 고정제가 한시간에 1mm 이상 침투하지 않을 것으로 추정되며, 10mm 두께의 표본의 중심까지 침투하려면약 25시간이 걸린다는 뜻입니다(예: 5mm(= 5² hours)).

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Figure 1: A composite photograph showing the rate at which 10% neutral buffered formalin penetrates into 25 mm cubes of liver. At the end of each time period a cube has been sliced to reveal the advancing fixation front. A: one hour (approximately 0.8 mm penetration), B: two hours (approximately 1.2 mm penetration), C: four hours (approximately 1.6 mm penetration) and D: eight hours (approximately 2.2 mm penetration). Note that after eight hours the centre of the specimen remains unfixed.
그림 1: 10%의 중성 완충 포르말린이 25mm 큐브 형태의 간으로 침투할 때의 침투율을 보여주는 합성 사진. 각 단위 시간이 끝날 때마다 큐브를 잘라 전진하는 고정 전면을 표시했습니다. A: 1시간(약 0.8mm 침투), B: 2시간(약 1.2mm 침투), C: 4시간(약 1.6mm 침투), D: 8시간(약 2.2mm 침투)8시간 후 표본의 중앙은 여전히 고정되지 않은 상태입니다.

표본 크기: 조직 고정 시 표본의 크기는 다음의 근사치를 따릅니다. 표본 두께는 4mm를 넘지 않습니다. 절편을 고정하고 처리하는 데 가장 이상적인 두께는 3mm입니다. 일반 처리 카세트의 표본 깊이는 5mm라는 점도 유념해야 합니다.

부피 비율: 조직의 총 부피 대비 많은 양의 고정제를 갖추는 것이 중요합니다. 고정제 첨가물을 사용하면 고정이 진행되면서 시약의 유효 농도가 줄어들어 고정 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 고정제 대 조직 비율의 최소 허용치는 20:1로 추천 비율은 50:1입니다.

pH 농도 및 완충: 광학현미경 검사에서 고정제의 pH 농도는 보존 능력에 큰 영향을 주지 않는것으로 보입니다. 실제 아세트산이나 피크린산 등을 포함한 많은 제제들은 pH가 낮은 편입니다.그러나 pH는 다른 이유로 중요할 수 있습니다. 예컨대 포름알데히드 용액은 포름산 용액으로 분해하는 과정에서 산성 용액을 형성하는데 이는 헤모글로빈과 반응해 인공 안료(산성 포름알데히드 헤마틴)를 생성합니다. 현재 가장 많이 쓰이는 포름알데히드 용액은 이러한 이유로 pH 6.8 -7.2의 완충용액으로 만들어 줘야 합니다. 전자현미경 검사에서는 pH 농도가 보다 중요하며 생리학적 pH2와 일치해야 합니다.

삼투질 농도: 고정제의 삼투압 효과는 광학현미경보다 초미세현미경 검사에서 더 중요한데 그 이유는 농도가 지나치게 낮은 저장액이나 높은 고장액은 인지질막을 쉽게 손상할 수 있기 때문입니다. 한편 삼투질 농도는 일상 조직병리학과 어느 정도 연관성이 있습니다. 일반적으로 가장중요한 것은 제제(완충제)의 삼투질 농도이며 일부 제제에서는 조직액(예. 등장성 식염수의 포르말린)과 비슷한 수준으로 조정하기도 합니다. 고정이 이루어지기 전에 세포는 물 같은 비등장성 용액에 의해 손상될 수 있으므로 검체를 즉시 고정할 수 없는 경우에는 등장성 식염수로 적신거즈를 이용해 잠시 촉촉하게 유지합니다. 조직을 장시간 식염수에 담그는 것은 바람직하지 않습니다.2

고정제

조직을 고정할 때 쓰는 시약에는 여러 가지가 있습니다. 여기서는 조직병리학에서 가장 많이 쓰이는 고정제 포름알데히드와 전자현미경이 필요한 초미세 연구에서 많이 쓰이는 글루타르알데히드를 소개합니다. 다른 종류의 시약은 3부에서 설명합니다.

포름알데히드: 포름알데히드(CH2O)는 유일한 기체 알데히드로 37% – 40% w/v에서 물에 포화 상태로 용해됩니다. 이 용액은 일반적으로 ‘포르말린’ 또는 ‘농축 포름알데히드 용액’이라 부릅니다.고정을 위해 포르말린을 물 또는 완충제와 1:9의 비율로 희석합니다. 그렇게 해서 나온 10% 포르말린 용액은 고정하기에 최적의 농도인 4% 포름알데히드 w/v를 갖고 있습니다. 고농축 용액에서 포름알데히드는 모노하이드레이트 메틸렌 글리콜과 저분자량의 고분자 하이드레이트로 존재합니다. 희석된 상태에서는 모노하이드레이트가 우세합니다. 파라포름알데히드는 고도화된 중합체형태의 포름알데히드로, 농축 포름알데히드 용액에 흰색 침전물로 침전될 수 있습니다. 이런 침전을 방지하기 위해 일반적으로 소량의 메탄올(최대 15%)을 용액에 추가합니다. 파라포름알데히드는 건조 분말로 구매할 수 있으며 전자현미경 검사에 필요한 고순도 포름알데히드 용액을 만드는 데 쓸 수 있습니다.2, 3

완충되지 않은 포르말린은 서서히 산화되어 포름산으로 변해 pH 농도를 떨어뜨립니다. 이런 조건에서 포름산은 헤모글로빈과 반응해 흑갈색의 과립형 인공 안료인 산성 포름알데히드 헤마틴을형성해 혈액이 풍부한 조직에 축적됩니다. 이 안료는 미생물이나 다른 병리학적 색소와 쉽게 혼동할 수 있어 골치 아픈 존재입니다. 4염색 전 포화 방수 피크린산으로 절편에서 안료를 제거할수 있지만 이런 색소의 형성을 애초에 방지하는 것이 더 바람직합니다. 또한 포름알데히드는 중성 pH에서 가장 효과적으로 반응하기 때문에 10% 포르말린 용액은 보통 pH 6.8 - 7.2의 완충용액으로 만들어줍니다.

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Figure 2: A formalin-fixed paraffin section of kidney showing the typical deposition of acid formaldehyde hematin (formalin pigment) associated with red blood cells. The pigment is brown to black in color and is birefringent under polarized light. In this case the specimen remained in fixative for an extended period before processing.
그림 2: 포르말린으로 고정한 신장의 파라핀 절편. 적혈구와의 반응으로 생긴 산성 포름알데히드헤마틴(포르말린 안료) 침전물의 전형적인 모습. 이 색소는 흑갈색으로 편광빛 아래에서는 복굴절 형태를 띱니다. 이 경우 검체는 처리 전 상당 기간 고정제에 있었습니다.

포름알데히드는 단백질의 사이드 체인과 반응해 반응성 히드록시-메틸군을 형성합니다. 이는 핵단백질과 핵산을 침투해 핵산-단백질 껍질을 안정시키고 자유 아미노 그룹과 반응해 뉴클레오타이드를 변형시킬 수 있습니다. 포름알데히드는 특히 칼슘 이온이 존재하는 경우 불포화 지질의 일부 집단과는 반응하는 반면 탄수화물과는 반응하지 않는 경향이 있습니다. 5포름알데히드는 라이신, 아르기닌, 시스테인, 티로신, 트레오닌, 세린, 글루타민과 반응해 반응성 복합체를 형성할 수있는데 이는 서로 결합해 메틸렌 다리(교차결합)를 형성하거나 수소 그룹과 결합할 수 있습니다. 5포말린 고정 후 조직을 세척하면 이런 반응 일부를 되돌릴 수 있지만 중요한 교차결합은 남아 있는 것으로 알려져 있습니다. 6포름알데히드는 세포 단백질의 펩타이드를 보존할 수 있는 능력이있는데, 바로 이 능력 덕분에 현재 범용 고정제로 유용하게 쓰이고 있습니다.

포름알데히드를 고정제로 사용하는 과정에서 피부나 눈, 호흡기에 포름알데히드가 노출되면 인체에 유해하다는 것이 알려졌습니다. 자극적이고 부식성 상해를 입힐 수 있으며 알레르기를 유발하기도 합니다. 프롬알데히드는 1981년 ‘인간에게 충분히 발암성 증거가 있는 물질’로 규정되었으며 2011년에는 ‘인간에게 발암성이 있는 것으로 확인된 물질’로 승격 분류되었습니다. 7, 8연구 결과 포름알데히드는 비인두암, 비부비동 종양, 골수성 백혈병을 유발한다는 것이 밝혀졌습니다. 이런 이유로 많은 국가에서 엄격한 관리지침을 통해 작업실 내 포름알데히드에 대한 근로자의 노출을 제한하고 있습니다. 예컨대 미국의 OSHA 허용 노출 한계(PEL)는 0.75ppm(8시간 TWA)이고 단기 노출 한계(STEL)는 2ppm(15분 노출)이며, 상시 모니터링 프로그램을 통해 권고안의 준수 여부를 확인하고 있습니다. 현대식 연기 흡입기 등 장비가 잘 갖춰진 실험실에서는 이 한계치를 초과해서는 안 됩니다.9, 10

포름알데히드의 유해성에도 불구하고 많은 형태학자들은 포르말린 고정 검체 검사를 통해 정상및 병변 조직에 대한 지식을 축적해 왔습니다. 지금은 이 시약의 독성에 대해 많이 알려진 만큼많은 실험실에서 더 안전한 대체제를 모색하고 있습니다. 포르말린의 대체제는 포르말린보다 우월하지는 않아도 최소 유사한 형태학적 결과물을 만들 수 있는지의 여부, 분자학적 방법을 포함한 모든 염색 방법이 가능한지의 여부, 그리고 포르말린과의 가격 경쟁력 등으로 판단합니다.많은 실험실에서는 이런 조건들을 충족시킬 만한 만족스러운 대체제를 찾지 못해 포르말린을 계속해서 사용하고 있습니다. 그렇기 때문에 직원들에게 포르말린의 위험성에 대해 충분히 알리는것이 중요합니다. 포름알데히드의 대체 물질에 대해서는 3부에서 다룹니다.

글루타르알데히드: 글루타르알데히드(CHO(CH2)3CHO)는 양기능 알데히드로, 분자 양끝에 알데히드집단이 있어 포름알데히드와 동일한 화학 집단과 반응할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 이들은 첨가 화합물이나 메틸렌 다리를 형성하기도 하지만 단일 글루타르알데히드 분자는 인접한펩타이드의 입체적 구조가 허락하는 한 직접 교차 결합을 형성할 수도 있습니다. 이 점에서 라이신의 아미노 그룹은 특히 중요합니다. 글루타르알데히드로 고정된 조직은 포르말린보다 교차 결합이 더 광범위하게 이루어지며 일부 비반응성 알데히드 그룹은 화학적으로 차단을 하지 않으면 PAS 와 같은 방법을 사용했을 때 배경염색을 유발합니다. 광범위한 교차 결합은 면역조직화학 염색에 부정적인 영향을 끼치지만 한편으로는 초미세구조를 훌륭히 보존해 전자현미경 검사에서 주요 고정제로 쓰입니다. 글루타르알데히드의 교차 결합 반응은 대체로 불가역적입니다. 글루타르알데히드는 매우 천천히 침투하므로 최소 한 단면의 조직 두께는 1mm 미만으로 하는 것을 권장합니다.5, 11

글루타르알데히드는 서서히 분해되어 글루타릭산을 형성하며 중합 반응을 일으켜 순환 및 올리고머 복합체를 형성합니다. 따라서 글루타르알데히드는 ‘전자현미경 검사를 위해 안정화된’ 밀봉앰플 형태로 주로 구할 수 있으며, 이는 완충용액 pH 7.2 - 7.4(주로 카코딜산, 인산염 또는 말레산)에 첨가해 사용하기에 적합한 3%의 농도로 만들 수 있습니다. 전자현미경 검사를 할 때에는글루타르알데히드로 1차 고정을 한 후 보통 오스뮴 테트록사이드로 2차 고정을 합니다. 글루타르알데히드는 일반 조직병리학에서는 쓰지 않습니다. 11

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Figure 3: An electron micrograph showing a Schmidt-Lanterman incisure in a myelinated nerve fibre. This specimen was fixed in buffered glutaraldehyde, washed in buffer then given secondary fixation in buffered osmium tetroxide, a standard procedure when preparing specimens for transmission electron microscopy. The multiple layers of phospholipid membrane forming the myelin sheath are well-preserved by this procedure.
그림 3: Schmidt-Lanterman 절흔 후 말이집 신경섬유를 전자현미경으로 찍은 사진. 검체를 완충 글루타르알데히드에 고정한 후, 완충액으로 세척, 이후 완충 오스뮴 테트록사이드로 2차 고정을 했습니다. 이는 투과 전자현미경 진단을 위한 일반적인 준비 방법입니다. 이 절차로 말이집 (수초)을 구성하는 여러 층의 인지질막을 잘 보존할 수 있었습니다.
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Figure 4: The Schmidt-Lanterman incisure in a myelinated nerve fibre shown at a higher magnification than in Figure 2. The multiple layers of phospholipid membrane forming the myelin sheath are well-preserved by the glutaraldehyde/osmium tetroxide fixation.
그림 4: 그림 2을 더 확대해서 본 Schmidt-Lanterman 절흔 후 말이집 신경섬유 사진. 글루타르알데히드/오스뮴 테트록사이드 고정으로 말이집(수초)를 구성하는 여러 층의 인지질막을 잘 보존할 수 있었습니다.

발표자 소개

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.

참조 문헌

  1. Medawar PB. The rate of penetration of fixatives. J Royal Micros Soc 1941;61;46-57.
  2. Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 1997.
  3. Leong AS-Y. Fixation and fixatives. In Woods AE and Ellis RC eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.1-1 - 4.1-26.
  4. Rolls GO, Farmer NJ, Hall JB. Artefacts in histological and cytological preparations. In Woods A and Ellis R eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;5.3-1 - 5.3-29.
  5. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol 2001;24;173 -190.
  6. Eltoum I, Fredenburgh J, Grizzle WE. . Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. J Histotechnol 2001;24;201-210.
  7. NTP. Report on carcinogens, Twelfth Edition. National Toxicology Program, USA Department of Health and Human Services, 2011; http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/roc/twelfth/roc12.pdf November 7, 2011
  8. NTP. Addendum to the 12th Report on Carcinogens. USA Department of Health and Human Services, National Toxicology Program, 2011; http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/roc/twelfth/Addendum.pdf November 7, 2011
  9. OSHA. Occupational Safety and Health Standards. Standard Number: 1910.1048 : Formaldehyde. United States Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration, 2011; http://www.osha.gov/pls/oshaweb/owadisp.show_document?p_id=10075&p_table=STANDARDS November 7, 2011
  10. Leica, Microsystems. Material Safety Data Sheet: 10% Millonig’s Buffered Formalin. 2007; http://www.leica-microsystems.com/index.php?id=1504&tx_leicaproducts_pi1[showUid]=3299&tx_leicaproducts_pi1[tab]=downloads&cHash=49baf1391ce5bcd25cd31e224782b369  27/10/2011
  11. Bozzola JJ, Russell LD. Electron microscopy: principles and techniques for biologists. Boston: Jones and Bartlett, 1992

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