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Spezialfärbungen – Welche, warum und wie? Teil 1: Muzine und Glykogen

„Spezialfärbung“ definieren

Spezialfärbung ist ein Begriff, der verwendet wird, um sich auf viele alternative Färbetechniken zu beziehen, die verwendet werden, wenn die traditionelle H&E nicht alle Informationen liefert, die der Pathologe oder Forscher von einem Gewebeobjektträger benötigt. „Spezialfärbungen“ sind Methoden zum Nachweis von Gewebebestandteilen, die auf der Affinität bestimmter Farbstoffe oder anderer Substanzen zu eben jenen Gewebekomponenten aufbauen. Sie ermöglichen es, die An- oder Abwesenheit bestimmter Zelltypen, Strukturen und/oder Mikroorganismen mikroskopisch darzustellen. Spezialfärbungen existierten lange vor der Immunhistochemie (IHC) und molekularen Techniken, die mit Sonden arbeiten. Es handelt sich also um verschiedene Methoden.

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Muzine – Eine kurze Einleitung

Muzine gehören zur großen und komplexen Gruppe der Kohlenhydrate. Die Kohlenhydrate lassen sich grob in Zucker und Stärken unterscheiden. Eine etwas genauere, wenn auch immer noch recht grobe Einteilung berücksichtigt Monosaccharide, Polysaccharide und Mukopolysaccharide als Arten von Kohlenhydraten. Muzine wiederum sind Mukopolysaccharide, die als Proteine verstanden werden können, denen lange Ketten von Zuckermolekülen anhängen. Sie sind im gesamten Körper zu finden und sorgen unter anderem für die strukturelle Integrität von Knochen, Knorpel, Haut, elastischem Bindegewebe und Membranen. Sie sind weiterhin wichtig für das Überleben und Wachstum der Zellen, da sie den Nährstofffluss zwischen Kapillaren und Zellen regulieren.

Im Wesentlichen gibt es zwei Arten von Muzinen:

Saure Muzine tragen negative Ladungen in den Kohlenhydratseitenketten. Eine weitere Unterteilung kann in Abhängigkeit davon erfolgen, ob die negative Ladung auf eine Carboxylgruppe (schwach saure Muzine) oder eine Sulfonatgruppe (stark saure Muzine) zurückzuführen ist. Sie sind im gesamten Gastrointestinaltrakt und den Atemwegen zu finden.

Neutrale Muzine hingegen tragen keine dieser funktionellen Gruppen und bleiben ungeladen. Sie befinden sich in der Magenschleimhaut und in den Brunner-Drüsen des Duodenums, aber auch im Prostataepithel. Sie schützen die Duodenalschleimhaut vor dem stark sauren Magensaft und helfen, ein alkalisches Milieu zu schaffen, in dem die Verdauungsenzyme optimal arbeiten können. Außerdem wirken sie in Darm und Prostata als Gleitmittel.

Saure Muzine – die drei gängigsten Färbungen

1) Alcianblau

Alcianblau ist ein basischer Farbstoff, der Kupfer enthält, was ihm seine blaue Farbe verleiht. Die Farbstoffmoleküle tragen eine positive Ladung und werden von den negativ geladenen Muzinen angezogen. Über eine Anpassung des pH-Werts der Alcianblau-Lösung lassen sich verschiedene Subtypen von Muzinen detektieren.

Bei einem pH-Wert von 2,5 ist eine umfassende Muzinfärbung zu erreichen:

  • Anfärbung carboxylierter, schwach saurer Muzine in Bindegewebe und Knorpel
  • Becherzellen im Barrett-Ösophagus

Bei einem pH-Wert von 1,0 werden vor allem sulfonierte, stark saure Muzine angefärbt, z. B. in folgenden Geweben:

  • Becherzellen des Dickdarms
  • Seromuköse Bronchialdrüsen
  • Adenokarzinome

Beispiele für Gewebe, in denen eine Alcianblau-Färbung zum Muzinnachweis gemeinhin positive Ergebnisse liefert:

  •  Becherzellen im Darm
Becherzellen im Darm
  • Becherzellen im Barrett-Ösophagus
Becherzellen im Barrett-Ösophagus
  •  Mukoide Kapsel von Mikroorganismen, hier Cryptococcus
Mukoide Kapsel von Mikroorganismen, hier Cryptococcus
  • Mastzellgranula, die die Identifikation dieser Immunzellen erleichtern
Mastzellgranula

Beispiele für pathologische Prozesse, bei deren Erkennung Alcianblau helfen kann:

  • Muzinöse Tumore

    • Karzinome, die aus mindestens 60 % Schleim bestehen, werden als muzinös bezeichnet
    • Muzinöse Tumore machen etwa 10-15 % aller Adenokarzinome aus
    • Im folgenden Bild ein Adenokarzinom, in dem die Schleimproduktion mit Alcianblau bestätigt wurde

Muzinöse Tumore
  • Myxödem, eine ödematöse Schwellung mit Ablagerung von Muzinen in der Haut und anderen Geweben
  • Myxom, ein seltener benigner Herztumor, der bei entsprechendem Wachstum aber den Blutfluss stören kann
Myxödem


Gewebeart

Bestandteile

Alcianblau bei pH = 2,5

Alcianblau bei pH = 1,0

Gastrointestinaltrakt

Neutrale Muzine

Negativ

Negativ

Prostata

Neutrale Muzine

Negativ

Negativ

Becherzellen

Schwach saure Muzine

Positiv

Negativ

Stroma

Schwach saure Muzine

Positiv

Negativ

Adenokarzinome

Stark saure Muzine

Negativ

Positiv

Knorpel, Knochen

Stark saure Muzine

Negativ

Positiv bei pH = 0,5


Hinweis: Alcianblau färbt keine neutralen Muzine an.

Die Methode

Das Protokoll – Die Inkubationszeiten können in Abhängigkeit vom Hersteller variieren

1.

Objektträger in Wasser eintauchen

2.

Alcianblau (pH-Wert der Lösung beachten!)

30 Min.

3.

Unter fließendem Wasser gründlich abspülen

2 Min.

4.

Gegenfärbung mit Kernechtrot

2 Min.

5.

Kurz unter fließendem Wasser abspülen

6.

Entwässern, klären, eindecken

 

Fehlerbehebung bei der Alcianblau-Färbung:

Kernechtrot sollte vor der Verwendung gut gemischt werden, da es dazu neigt, sich abzusetzen, was sich nachteilig auf die Färbung auswirkt. Kontrollieren Sie den pH-Wert der Alcianblau-Lösung, um falsch negativen Ergebnissen vorzubeugen.

2) Kolloidales Eisen

Kolloidales Eisen erlaubt die Visualisierung von sauren Muzinen. Dank seiner hohen Sensitivität lassen sich auch geringste Mengen saurer Muzine darstellen und in diesem Kontext wird es zuweilen als Alternative zur Alcianblau-Färbung genutzt. Von Bedeutung ist die Färbung mit kolloidalem Eisen beispielsweise für die Diagnose von Nierenzellkarzinomen und bestimmten Mesotheliomen. Mesotheliome gehen vom Mesothel aus, also von der Pleura, dem Peritoneum und den serösen Häuten vieler Organe.

Kolloidales Eisen

Die Methode

Die Methode beruht auf der Anziehung zwischen positiv geladenen Eisenionen (ferrischen Kationen) und negativ geladenen Gruppen in Muzinen. An Muzine gebundene Eisenionen werden dann mit Kaliumferrocyanid/HCl nachgewiesen, wobei sich ein intensiv blauer Niederschlag bildet.

Die Methode beruht auf der Anziehung zwischen positiv geladenen Eisenionen (ferrischen Kationen) und negativ geladenen Gruppen in Muzinen. An Muzine gebundene Eisenionen werden dann mit Kaliumferrocyanid/HCl nachgewiesen, wobei sich ein intensiv blauer Ni
Ergebnisse: saure Muzine tiefblau, Zellkerne pink, Zytoplasma rosa
Ergebnisse: saure Muzine tiefblau, Zellkerne pink, Zytoplasma rosa

Das Protokoll – Die Inkubationszeiten können in Abhängigkeit vom Hersteller variieren

1.

Objektträger in Wasser eintauchen

2.

Inkubation in Eisessig 12 %

12 Min.

3.

Sofort in kolloidale Eisenlösung überführen

60 Min.

4.

In Eisessig 12 % spülen

3 Min.

5.

Eisessig wechseln, noch einmal spülen

3 Min.

6.

Ferrocyanid/HCl-Lösung

20 Min.

7.

Unter fließendem Wasser abspülen

2 Min.

8.

Gegenfärbung mit Kernechtrot

5 Min.

9.

Kurz unter fließendem Wasser abspülen

10.

Entwässern, klären, eindecken

Fehlerbehebung bei der Färbung mit kolloidalem Eisen und Umgang mit unspezifischer Hämosiderinfärbung:

  • Zwei Objektträger A und B mit den gleichen Proben vorbereiten
  • Inkubation von Objektträger A über das gesamte Protokoll
  • Inkubation von Objektträger B nur nach Rehydratation in Kaliumferrocyanid/HCl-Lösung
  • In der Auswertung von Objektträger B sind alle positiven Färbeergebnisse zu ignorieren, die auch auf Objektträger A zu sehen sind

3) Muzikarmin – Ein hochspezifischer Farbstoff für Muzin epithelialen Ursprungs

Lange bevor immunhistochemische Verfahren zur Verfügung standen, hat man Siegelringzellkarzinome über die Muzikarminfärbung identifiziert. In den Zellen dieser malignen Tumore bildet sich so viel Schleim, dass der Zellkern an den Rand gedrängt wird, was zur charakteristischen Form des Siegelrings führt.

Siegelringzellkarzinome lassen sich mithilfe dreier Methoden erkennen:

Methoden zur Diagnose von Siegelringzellkarzinomen

Die Muzikarminfärbung wird auch verwendet, um zwischen Muzin-negativen Plattenepithelkarzinomen und Muzin-positiven Adenokarzinomen zu unterscheiden.

Muzin-negatives Plattenepithelkarzinom und Muzin-positives Adenokarzinom

Ein weiteres Beispiel für eine positive Muzikarminfärbung:

positive Färbung mit Muzikarmin

Die Methode

Karmin ist ein Farbstoff, der aus den Körpern von weiblichen Cochenilleschildläusen gewonnen wird. Sein wichtigster Bestandteil ist Karminsäure, die mit Aluminiumsalzen gebeizt wird, ganz ähnlich wie Hämatoxylin. Dabei entsteht ein positiv geladener Komplex, der von den negativ geladenen sauren Muzinen angezogen wird.

Muzikarmin – Die Methode

Das Protokoll – Die Inkubationszeiten können in Abhängigkeit vom Hersteller variieren

-

Objektträger in Wasser eintauchen

-

Hämatoxylin nach Weigert

5-10 Min.

-

Unter fließendem Wasser abspülen

-

Muzikarmin

20-30 Min.

-

Unter fließendem Wasser abspülen

-

Metanilgelb

1-3 Min.

-

Kurz unter fließendem Wasser abspülen

-

Entwässern, klären, eindecken

 

Fehlerbehebung bei der Muzikarminfärbung:

Befolgen Sie beim Ansetzen der Muzikarminlösung die Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie nur geeignetes Wasser und richten Sie sich auch bezüglich der Verdünnung nach den Herstellerempfehlungen. Wenn Sie versuchen, mit unverdünntem Muzikarmin zu färben oder eine ungeeignete Lösung verwenden, werden Sie nicht die gewünschten Resultate erzielen. Auch eine längere Inkubationszeit kann diese Fehler nicht ausgleichen. Das Hämatoxylin nach Weigert sollte frisch angesetzt sein. Wenn es nicht mehr violett, sondern bräunlich erscheint, hat es sich zersetzt und wird keine zufriedenstellende Kernfärbung liefern. Einmal angesetztes Hämatoxylin nach Weigert sollte im Laufe desselben Tages verwendet werden, am Folgetag aber nicht mehr. Gehen Sie sparsam mit dem Metanilgelb um, das Sie zur Gegenfärbung nutzen.

Kolonschleimhaut
Kolonschleimhaut

Neutrale Muzine – die wichtigste Färbung

1) Perjodsäure-Schiff-Reaktion (PAS)

Die Perjodsäure-Schiff-Reaktion oder PAS-Färbung ist eine sehr vielseitige Kohlenhydratfärbung, mit der sich neben neutralen Muzine auch Glykogen darstellen lässt. Auch schwach saure Muzine in Epithelzellen werden angefärbt, wobei dafür nicht die negative Ladung der Muzine, sondern die Struktur der Kohlenhydratseitenketten entscheidend ist.

Die Methode

Methode

Das Protokoll – Die Inkubationszeiten können in Abhängigkeit vom Hersteller variieren

-

Objektträger in Wasser eintauchen

-

Perjodsäure 0,5 % zur Oxidation

5 Min.

-

Schiff-Reagens

15 Min.

-

Unter fließendem Wasser abspülen

5 Min.

-

Mayers Hämatoxylin

1 Min.

-

Unter fließendem Wasser abspülen

1 Min.

-

Entwässern, klären, eindecken

Saure Muzine und neutrale Muzine auf demselben Objektträger darstellen

1) Alcianblau / PAS

Die Methode

Alcianblau färbt die sauren Muzine an und die neutralen Muzine werden im Rahmen der PAS-Reaktion gefärbt

Alcianblau färbt die sauren Muzine an und die neutralen Muzine werden im Rahmen der PAS-Reaktion gefärbt

Ergebnisse:

Alcianblau / PAS

Das Protokoll – Die Inkubationszeiten können in Abhängigkeit vom Hersteller variieren

1.

Objektträger in Wasser eintauchen

2.

Alcianblau

15 Min.

3.

Unter fließendem Wasser abspülen

12 Min.

4.

Perjodsäure

5 Min.

5.

Unter fließendem Wasser abspülen

6.

Schiff-Reagens

10 Min.

7.

Unter fließendem Wasser abspülen

5 Min.

8.

Mayers Hämatoxylin

1 Min.

9.

Unter fließendem Wasser abspülen

10.

Entwässern, klären, eindecken

 Fehlerbehebung bei der Alcianblau/PAS-Färbung:

  • Alcianblau-Lösung auf einen pH-Wert von 2,5 einstellen
  • Sicherstellen, dass die Perjodsäure frisch angesetzt ist
  • Schiff-Reagens gemäß den Angaben des Herstellers lagern

Glykogen

Glukose ist die wichtigste Energiequelle der Zellen. Glukose, die nicht sofort gebraucht wird, wird in eine Speicherform überführt und in Leber und Muskeln gespeichert. Diese Speicherform der Glukose wird als Glykogen bezeichnet. In Momenten, in denen Energie benötigt, aber keine Nahrung zugeführt wird, die Glukose liefern würde, wird Glykogen wieder zu Glukose abgebaut.

Wie Glykogen dargestellt werden kann:

Perjodsäure-Schiff-Reaktion – Mithilfe der PAS-Reaktion lässt sich Glykogen in der Leber, in den Basalmembranen, aber auch in bestimmten Nieren-, Blasen-, Eierstock- und Bauchspeicheldrüsentumoren sowie in Pilzen nachweisen.

Beispiele für Gewebe, das in der Regel eine positive PAS-Reaktion zeigen:

Fungus
Fungus
Basement Membrane
Basement Membrane

Die Präsenz von Glykogen und sein Verteilungsmuster sind für die Diagnose verschiedener Krankheiten relevante Befunde:

  • Glykogenspeicherkrankheiten,

  • darunter Morbus Pompe, wobei die Akkumulation von Glykogen eine generalisierte, fortschreitende Myopathie verursacht, die sich vor allem in Form einer Muskelschwäche manifestiert, aber auch das Herz, die Leber und das Nervensystem betreffen kann

  • Rhabdomyosarkom, eine bösartige Neubildung der Skelettmuskulatur

  • Mesotheliom

Die Methode

Die Präsenz von Glykogen und sein Verteilungsmuster sind für die Diagnose verschiedener Krankheiten relevante Befunde:

Fehlerbehebung bei der PAS-Reaktion:

Es ist wichtig, dass die Perjodsäure unverdünnt und entsprechend stark bleibt. Informieren Sie sich in der Produktinformation über die richtige Lagerung von Schiff-Reagens.

Wie sich Glykogen von anderen PAS-positiven Elementen unterscheiden lässt:

PAS-D – Perjodsäure-Schiff-Reaktion mit Diastasetest

Diastase ist ein Malzextrakt, das die Enzyme α- und β-Amylase enthält, die beide dem Abbau von Polysacchariden dienen. Heute bezeichnet man sowohl α- als auch β-Amylase als Diastase. Im Rahmen einer Diastase-Verdauung wird Glykogen in kleinere Zuckermoleküle aufgespalten, die dann ausgewaschen werden können.

So lässt sich eine Diastase-Verdauung durchführen, um Glykogen von anderen PAS-positiven Molekülen zu differenzieren:

  1. Bereiten Sie zwei Objektträger mit Schnitten derselben Probe vor.
  2. Behandeln Sie Objektträger A ausschließlich mit Wasser oder Puffer.
  3. Behandeln Sie Objektträger B mit Diastase (0,25 g α-Amylase in 50 ml destilliertem Wasser)
  4. Färben Sie beide Objektträger mit PAS gemäß dem oben beschriebenen Protokoll
  5. Entwässern, klären, eindecken

Ergebnisse:

Slide A shows a strong PAS reaction
Slide A shows a strong PAS reaction
Slide B staining disappears after diastase digestion
Slide B staining disappears after diastase digestion

Bereiche, die auf dem unbehandelten Objektträger A PAS-positiv und auf dem behandelten Objektträger B PAS-negativ sind, entsprechen Glykogen. Im Gegensatz dazu bedeutet ein positives Ergebnis auf beiden Objektträgern, dass die angefärbte Substanz nicht vom Enzym abgebaut wurde und es sich demzufolge nicht um Glykogen handelt.

Fehlerbehebung bei PAS-D:

Vergewissern Sie sich, dass die Perjodsäure frisch angesetzt und das Schiff-Reagens stabil ist. Es macht definitiv einen Unterschied, ob Sie das richtige Enzym verwenden oder nicht. Verdünnen Sie das Enzym gemäß den Angaben im Protokoll und machen Sie sich klar, dass Glykogen das ist, was nach der Diastase-Verdauung nicht mehr zu sehen ist. Mit ein bisschen Ruhe ist das sehr gut nachvollziehbar.

Nebenbei:Menschlicher Speichel enthält Amylase und könnte in der PAS-D-Färbung anstelle der kommerziell erhältlichen Diastase eingesetzt werden.

References

Referenzen

Rolls G. 101 Schritte zu einer besseren Histologie – Ein praktischer Leitfaden zur guten histologischen Praxis. Leica Biosystems Knowledge Pathway.

Dorst D. The Role of Mucopolysaccharides in Good Health. Aquaculture Inc., 2012.

Shaikh I. Special Stains in Histopathology. Kem Hospital, 2012.

Ellis R. Alcian Blue and PAS Staining Protocols. IMVS Division of Pathology, The Queen Elizabeth Hospital, Woodville, South Australia.

Mowry, RW. Alcian blue technics for the histochemical study of acidic carbohydrates. J Histochem Cytochem, 1956;4;407.

Myers R. Spezielle Färbetechniken für die Bewertung von Muzinen. Leica Biosystems Knowledge Pathway.

Pernick N. Muzins. Pathology Outlines, January 26, 2016

Sheehan D, Hrapchak B. Theory And Practice Of Histotechnology. 2nd ed. Ohio: Battelle Press, 1987.

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