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固定和固定剂 - 常用固定溶液

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

在固定和固定剂系列的第四部分,我们介绍了过去 100 年来在组织学中一直使用的许多常用和传统固定溶液中的某些固定溶液。这部分还概述了专有溶液,并提供有关如何针对您的应用选择正确固定剂的建议。

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常用固定溶液

下面列出了一些更常见和传统的固定溶液(点击每行了解详情)。这并不是完全清单,因为在过去一百年或更长的时间内,已发表的固定剂和固定剂混合物变更达数百个。选择的试剂仅代表大多数试剂。其中一些试剂可以向商业供应商购买即用型。1-4

 

  1. 磷酸盐缓冲福尔马林
  2. 福尔马林钙
  3. 福尔马林盐水
  4. 锌福尔马林(无缓冲)
  5. Zenker 固定剂
  6. Helly 固定剂
  7. B-5 固定剂
  8. Bouin 溶液
  9. Hollande
  10. Gendre 溶液
  11. Clarke 溶液
  12. Carnoy 溶液
  13. Methacarn
  14. 酒精福尔马林
  15. 福尔马林醋酸酒精
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图 1:一种用水稀释后生成中性缓冲福尔马林溶液的市售“浓缩液”。
图 1:一种用水稀释后生成中性缓冲福尔马林溶液的市售“浓缩液”。

1. 磷酸盐缓冲福尔马林

配方

  • 40% 甲醛:100 ml
  • 蒸馏水:900 ml
  • 磷酸二氢钠一水合物:4 g
  • 无水磷酸氢二钠 6.5 g
  • 溶液的 pH 值应为 6.8
  • 固定时间:12 - 24 小时

建议的应用

用于常规组织病理学的使用最广泛的 甲醛固定剂 。这种缓冲液容易预防福尔马林色素的形成。许多表位需要回收抗原,以便在使用后成功进行 IHC。大多数病理学家都能自如地解释使用这种固定剂产生的形态。

2. 福尔马林钙

配方

  • 40% 甲醛:100 ml
  • 氯化钙:10 g
  • 蒸馏水:900 ml
  • 固定时间:12 - 24 小时

建议的应用

建议用于保存脂质,尤其是磷脂。

3. 福尔马林盐水

配方

  • 40% 甲醛:100 ml
  • 氯化钠:9 g
  • 蒸馏水:900 ml
  • 固定时间:12 - 24 小时

建议的应用

甲醛和等渗盐水这种混合物在引入磷酸盐缓冲福尔马林之前广泛用于常规组织病理学。它通常产生福尔马林色素。

4. 锌福尔马林(无缓冲)

配方

  • 硫酸锌:1 g
  • 去离子水:900 ml
  • 搅拌直至溶解,然后添加 -
  • 40% 甲醛:100 ml
  • 固定时间:4 - 8 小时

建议的应用

锌福尔马林溶液被设计作为氯化汞制剂的替代品。据说,用于 IHC 时可改善结果。有许多替代配方可用,其中一些含有氯化锌,氯化锌被认为比硫酸锌略微更具腐蚀性。

5. Zenker 固定剂

配方

  • 蒸馏水:950 ml
  • 氯化汞:50 g
  • 重铬酸钾:25 g
  • 冰醋酸:50 ml
  • 固定时间:4 - 24 小时

建议的应用

提供良好的胞核保存效果,但由于存在醋酸,会裂解红细胞。建议用于充血标本,在 PTAH 和三色染色时可产生良好结果。会产生应在染色前从切片中去除的汞色素,如果在处理前未用水洗涤组织,则会产生铬色素。是一种不耐受的药物,因此在水洗后,组织应保存在 70% 乙醇中。

6. Helly 固定剂

配方

  • 蒸馏水:1000 ml
  • 重铬酸钾:25 g
  • 硫酸钠:10 g
  • 氯化汞:50 g
  • 在使用前立即添加 –
  • 40% 甲醛:50 ml
  • 固定时间:4 - 24 小时

建议的应用

被认为非常适用于骨髓、髓外造血和心肌闰盘。

会产生应在染色前从切片中去除的汞色素,如果在处理前未用水洗涤组织,则会产生铬色素。是一种不耐受的药物,因此在水洗后,组织应保存在 70% 乙醇中。由于这种固定剂的 pH 值低,还可能会产生福尔马林色素。

7. B-5 固定剂

配方

原液

  • 氯化汞:12 g
  • 无水醋酸钠:2.5 g
  • 蒸馏水:200 ml

工作溶液,用前即刻制备

  • 工作溶液,用前即刻制备
  • 固定时间:4 - 8 小时

建议的应用

尽管含汞且之后有处置问题,这种固定剂常用于造血和淋巴组织的固定。它可提供出色的胞核详细信息,通过许多特殊染剂提供良好的结果,建议用于 IHC。切片需要在染色前去除汞色素。组织不应保存在这种固定剂中,而应该放在 70% 乙醇中。

8. Bouin 溶液

配方

  • 苦味酸饱和水溶液 (2.1%):750 ml
  • 40% 甲醛:250 ml
  • 冰醋酸:50 ml
  • 固定时间:4 - 18 小时

建议的应用

用于随后用三色染色的组织时可产生非常好的结果。保留了糖原,但通常会裂解红细胞。有时建议用于胃肠道活检、动物胚胎和内分泌腺组织。由于苦味酸,组织被染为明黄色。在用 70% 乙醇染色前,应洗去组织中过量的苦味酸。由于具有酸性,它会缓慢酸蚀掉小块钙沉积物和铁沉积物。

9. Hollande

配方

  • 醋酸铜:25 g
  • 苦味酸:40 g
  • 40% 甲醛:100 ml
  • 醋酸:15 ml
  • 蒸馏水:1000 ml

在蒸馏水中溶解化学物质,不加热。

  • 固定时间:           4 - 18 小时/li>

建议的应用

建议用于胃肠道标本和内分泌组织固定。裂解度低于 Bouin。有一些脱钙特性。

如要将组织放入处理机上的磷酸盐缓冲福尔马林中,则必须洗去固定剂,因为会形成不溶性磷酸盐沉淀物。

10. Gendre 溶液

配方

  • 苦味酸饱和的 95% 乙醇:800 ml
  • 40% 甲醛:150 ml
  • 冰醋酸:50 ml
  • 固定时间:4 - 18 小时

建议的应用

这是一种含酒精的 Bouin 溶液,在老化时作用显示增强。强烈建议用于保存糖原和其他碳水化合物。固定后,将组织放入 70% 乙醇中。染色前,应洗去残留的黄色物质。

11. Clarke 溶液

配方

  • 乙醇(无水):75 ml
  • 冰醋酸:25 ml
  • 固定时间:3 - 4 小时

建议的应用

已用于冷冻切片和涂片。如果固定时间非常短,则在常规处理后可以产生较好的结果。保存核酸,但要提取脂质。组织可直接转移到 95% 乙醇中。

12. Carnoy 溶液

配方

  • 无水乙醇:60 ml
  • 氯仿:30 ml
  • 冰醋酸:10 ml
  • 固定时间:1 - 4 小时

建议的应用

作用快,可很好地保存胞核,同时保留糖原。它可裂解红细胞并溶解脂质,并会产生过度硬化和收缩效果。

13. Methacarn

配方

  • 无水甲醇:60 ml
  • 氯仿:30 ml
  • 冰醋酸:10 ml
  • 固定时间:1 - 4 小时

建议的应用

与 Carnoy 有相似的特性,但收缩和硬化效果不那么好。

14. 酒精福尔马林

配方

  • 40% 甲醛:100 ml
  • 95% 乙醇:900 ml
  • 可加入 0.5 g 醋酸钙以确保中性
  • 固定时间:12 - 24 小时

建议的应用

结合一种变性剂和添加剂,具有福尔马林的交联作用。有时在处理期间用来在福尔马林初步固定不完全后完成固定。可用于大脂肪标本(尤其是乳腺)的固定或固定后流程,因为它可以在清除和提取脂质时更容易检测淋巴结。如果用于初步固定,则标本可直接放入 95% 乙醇中处理

15. 福尔马林醋酸酒精

配方

  • 无水乙醇:85 ml
  • 40% 甲醛:10 ml
  • 冰醋酸:5 ml
  • 固定时间:1 - 6 小时

建议的应用

一种比酒精福尔马林作用更快的试剂,因为存在还可能产生福尔马林色素的醋酸。有时用于固定诊断用冷冻切片。如果用于初步固定,则标本可直接放入 95% 乙醇中处理。

专利固定液

在过去几年中,已开发用于组织病理学和医学研究的专利固定剂数量越来越多。它们上市后通常作为传统福尔马林固定剂的危险性更低的替代品,或作为含汞(如 B5)固定剂混合物的毒性较低的替代品。

即使必须提供物料安全数据表 (MSDS),但通常不会发表这些试剂的确切构成,因此潜在用户不得不凑合着用试剂的一般说明。建议用作 B5 和 Zenker(常用于固定淋巴和造血组织)替代品的试剂通常含有锌或钡盐以及比例较低的甲醛,而 直接福尔马林替代物 通常含有乙二醛和其他组分。在后一组中,发现建议用于微波辅助固定的试剂(见第 5 部分)。某些配方中包含乙醇、甲醇和异丙醇。 5

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图 2:两个专利固定液示例。根据制造商的说明,建议使用含酒精、氯化钡和 10% 福尔马林的“Fix-All”来固定所有类型的组织,并作为含汞的 B-5 固定剂的替代品。“O-Fix”含酒精、福尔马林和醋酸,也可用于固定所有类型的组织,但尤其建议用于在切开期间标示淋巴结。
图 2:两个专利固定液示例。根据制造商的说明,建议使用含酒精、氯化钡和 10% 福尔马林的“Fix-All”来固定所有类型的组织,并作为含汞的 B-5 固定剂的替代品。“O-Fix”含酒精、福尔马林和醋酸,也可用于固定所有类型的组织,但尤其建议用于在切开期间标示淋巴结。

我应该使用哪种固定剂?

在大多数建立的实验室,已经选择一种常规固定剂或多种固定剂,并对一系列标本类型使用了相当长的时间。病理学家、组织学家或研究人员将完全习惯于解读某种特定固定剂和处理产生的特殊组织形态。最常见的是,常规固定剂将是中和缓冲福尔马林结合其他用于骨髓环钻(也许是锌福尔马林)、肾活检、冷冻切片等的试剂。缓冲福尔马林应用广泛,因为它可能是最灵活的试剂。它可以加入封闭式组织处理机上的处理时间表中。有了它,便可成功应用广泛的特殊染剂免疫组织化学方法(通常包括一个抗原回收步骤)已对福尔马林固定的组织进行了优化,组织标本可以长时间保存在福尔马林中,没有重大的有害影响。ISH 等分子技术还经验证可用于福尔马林固定的组织。必须根据这些特征判断新的或替代的固定剂。5-6

目前,有些实验室正在寻求用一种毒性较低的试剂来替代福尔马林,前面的段落已描述了几种替代品。在研究特定组织组分的环境中,可能对固定步骤有更多控制,在做出最终决定之前测试多种试剂是值得的。如果您正在考虑更换固定剂,除了评估您在显微镜下看到的结果外,还需考虑以下特性:

  • 固定剂的毒性(短期和累积)
  • 其组分挥发性和设备可用性,以防止工作人员接触试剂
  • 易燃性
  • 过度固定对组织的影响(固定时间延长是否会损坏组织?)
  • 保存要求,如果标本不能留在固定剂中
  • 固定剂是否适合您的组织处理机(是否可能会损坏组分?)
  • 有关用后处置的实际和法律要求

更换为一种不同的固定剂需要非常仔细的考虑和彻底的评估。

 

References

  1. Eltoum I, Fredenburgh J, Myers RB, Grizzle WE. Introduction to the theory and practice of fixation of tissues. J Histotechnol 2001;24;173 -190.
  2. Leong AS-Y. Fixation and fixatives. In Woods AE and Ellis RC eds. Laboratory histopathology. New York: Churchill Livingstone, 1994;4.1-1 - 4.1-26.
  3. Hopwood D. Fixation and fixatives. In Bancroft J and Stevens A eds. Theory and practice of histological techniques. New York: Churchill Livingstone, 1996.
  4. Carson FL. Histotechnology. 2nd ed. Chicago: ASCP Press, 2007.
  5. Titford ME, Horenstein MG. Histomorphologic Assessment of Formalin Substitute Fixatives for Diagnostic Surgical Pathology. Arch Pathol Lab Med 2005;129;502-506.
  6. Kothmaier H, Rohrer D, Stacher E, Quehenberger F, Becker K-F, Popper HH. Comparison of Formalin-free Tissue Fixatives: A Proteomic Study Testing Their Application for Routine Pathology and Research. Arch Pathol Lab Med 2011;135;744-752.

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About the presenter

Geoffrey Rolls, BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.

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