일상 및 특수 염색 소개

조직을 염색하여 살펴보기 전에 세포 하나의 두께 정도되는 매우 얇은 절편으로 절단하여 현미경 슬라이드에 놓을 수 있도록 준비해야 합니다. 조직을 고정(조직 손상 방지)시킨 다음 매우 얇은 두께(일반적으로 2~7µm)로 절단할 수 있도록 경화시키고 조직 내 공간을 채워야 합니다. 이를 위해 사용되는 두 가지 주요 기법은 동결 절편과 파라핀 포매 절편이라고 합니다.

동결 절편은 일반적으로 외과 의사가 종양 제거 수술 중에 절제면을 빠르게 알아야 할 때 사용됩니다. 신속하게 절편을 만들 수는 있지만, 파라핀을 이용한 방법만큼 품질이 좋지는 않습니다. 동결 절편 준비 과정은 다음과 같습니다.

1. 조직을 보존하고 경화시키기 위해 빠르게 냉동시킵니다.
2. 동결된 조직은 저온 유지 장치(동결실에 있는 절단 마이크로톰)에서 절단한 후 현미경 슬라이드 위에 놓고 염색을 합니다.
3. 절편이 부서지지 않도록 단단히 고정한 후 염색합니다.

파라핀 절편을 준비할 때, 먼저 고정액으로 표본을 보존한 다음 파라핀 왁스로 표본을 침윤시켜 조직 구조를 단단하게 만듭니다. 이 과정은 동결 절편보다 시간이 더 오래 걸리지만 대부분의 경우 염색된 조직의 품질이 더 좋기 때문에 결과 샘플(블록)을 거의 영구적으로 보관할 수 있습니다. 파라핀 절편 준비 과정은 다음과 같습니다.

1. 고정은 조직을 보존하는 과정입니다(일반적으로 포름알데히드 용액)사용).
2. 육안검사는 절편을 만들 조직의 특정 영역을 분리하는 과정입니다
3. 조직 처리는 시약을 사용하여 친수성 환경을 소수성 환경으로 바꿔 조직 구성 요소를 파라핀 왁스에 침윤시키는 과정입니다.
4. 포매는 표본의 방향을 설정하고, 절편 절단 및 보관을 위해 왁스를 표본 안에 침투시켜 단단하게 경화시키는 과정입니다.
5. 마이크로톰에서 미세한 두께로 조직을 절단한 다음 물에 띄워 현미경 슬라이드로 건져 올려 놓습니다.
6. 그런 다음 수분을 제거하고 조직이 슬라이드에 잘 달라붙도록 슬라이드를 오븐이나 따뜻한 접시 위에 올려서 건조시킵니다.
7. 이제 슬라이드에 올려놓은 조직을 염색할 준비가 되었습니다.
8. 첫 번째 염색 단계는 왁스를 제거하는 과정으로 염색 전에 용매를 사용하여 슬라이드에서 왁스를 제거합니다. 이 작업은 항상 염색 과정의 일부로 수행됩니다. 염색이 끝나면 절편을 커버 글라스로 덮어서 영구 보관합니다.

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 병리학자/연구원들이 조직에 대한 매우 상세한 정보를 얻을 수 있어 조직병리학 실험실에서 가장 많이 사용하는 염색 방법입니다. 이 염색법을 통해 세포질, 핵, 세포 기관 및 세포외 기질을 포함하여 세포 구조를 확연하게 구분할 수 있습니다. 이 정보는 종종 세포의 구성(또는 해체)에 기반하여 질병 진단의 충분한 가능성을 제공하며, 또한 실제 세포의 이상이나 특정 지표(예, 암에서 일반적으로 관찰되는 핵 변화)를 관찰할 수 있게 합니다. 고급 염색법을 사용하더라도 H&E 염색은 병리학자/연구원들이 고급 염색을 올바르게 해석할 수 있는 기초적인 조직 형태학을 보여주기 때문에 진단 시 중요한 정보를 제공합니다.

임상 조직학 실험실의 모든 검체는 먼저 H&E으로 염색을 한 다음 두 가지 형태가 유사한 암을 구별하기 위한 경우처럼 더 상세한 분석을 위해 추가 정보가 필요한 경우에만 특수 염색 또는 고급 염색을 수행합니다

필요한 H&E 염색 양을 정확하게 결정해야 하므로 이제 대부분의 임상 실험실에서는 100% 자동화된 시스템을 사용하며, 수동 염색 방법을 사용하는 경우는 매우 드뭅니다.

H&E 염색은 헤마톡실린과 에오신 이렇게 두 가지 염료를 사용합니다. 이 조합은 서로 다른 조직 구성 요소를 염색할 때 사용됩니다.

헤마톡실린은 염기성 염료처럼 자줏빛 청색으로 반응합니다. 세포핵(DNA와 핵단백질)과 리보솜과 같은 RNA, 조면소포체가 있는 세포 기관 등 산성 또는 염기성 구조를 염색합니다.

에오신은 산성 염료로 붉은색 또는 분홍색으로 반응합니다. 이는 세포질, 세포벽, 세포외 섬유를 포함하는 염기성 또는 호산성 구조를 염색합니다.

염료 추출

헤마톡실린은 로그우드에서 추출하여 정제합니다. 산화 과정을 거쳐 매염제(일반적으로 알루미늄)와 혼합되면 세포 구조에 결합할 수 있게 됩니다. 조직학에서 사용되는 다양한 헤마톡실린 준비 과정 중에 길(Gill)과 해리스(Harris), 메이어(Mayer) 헤마톡실린이 가장 많이 사용되고 있습니다.

에오신은 브롬과 플루오레세인의 반응으로 형성됩니다. 조직학에서 일반적으로 사용되는 에오신 용액은 약간 노란빛을 띄는 에오신 Y와 약간 파란빛을 띄는 에오신 B 이렇게 두 가지 종류가 있습니다. 에오신 Y가 가장 많이 사용됩니다.

특수 염색이라는 용어는 보통 H&E를 제외한 모든 염색법을 가리킵니다. 특정 조직 구조, 구성 요소뿐만 아니라 H&E 염색으로 식별이 불가능한 미생물을 시각화하는 데 사용되는 다양한 방법을 아우르는 개념입니다.

다른 염색 방법은 면역 조직화학법 또는 동소교합법을 사용하여 특정 단백질 또는 DNA/RNA 서열을 표적으로 합니다. 이러한 방법은 “특별 염색” 범위에 포함시키기도 했지만 방법과 목적이 상당히 다르기 때문에 이제는 “고급 염색”이라는 세 번째 범주로 분리하고 있습니다.

모든 목적에 따라 수백 가지가 넘는 특수 염색 방법이 존재하지만, 임상 조직학에서는 주로 몇 가지 방법만을 사용하고 있습니다. 특수 염색은 그 방법이 다양하기 때문에 H&E 염색처럼 자동화되지는 않았습니다. 많은 대규모 실험실에서 자동화된 장비를 사용하고 있지만 일부는 직접 염색을 하는 경우도 있습니다. 일부 염색은 그 과정이 복잡해 자동화 장비의 사용이 비효율적일 수 있습니다.

아래 이미지는 가장 많이 사용되는 특수 염색과 그 적용 사례입니다.

라이카 바이오시스템즈의 비전은 암 진단 방법을 개선하여 삶의 질을 높이는 데 있습니다. 이를 위한 한 가지 방법으로 염색 품질을 개선해 나가고 있습니다. IHC와 IHC 품질은 염료에서 시작되지 않는다는 사실을 잘 알고 있기 때문에 이 시리즈에서는 염색 품질의 다양한 측면을 깊이 살펴보고 향후 테스트가 진단 개선에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지 고찰해봅니다.

수행하는 염색을 통해 무엇을 입증하고자 하는지 파악합니다.

단순히 “방법만 따르고” 완성된 절편에서 무엇을 보고자 하는지 잘 모른다면 원하는 결과를 얻을 수 없습니다

항상 증명하고자 하는 구조/물질이 들어 있는 것으로 알려진 대조군 슬라이드를 사용하십시오.

“염색 중인 구조/물질이 슬라이드에서 보이지 않는다면 해당 구조/물질이 존재하지 않는다고 가정합니다.”

정확한 시간을 적용하십시오.

시간은 항상 근사치입니다. 부정확한 시간은 일관성 없는 결과를 낳습니다.

사용 중인 시약의 유통 기한을 확인하십시오. 매우 불안정하고, 서서히 변질되므로 항상 새로 만들어 즉시 사용해야 합니다. 시약에 따라 사용하기 전에 산화(숙성) 과정을 위해 일정 시간 동안 방치해 두어야 합니다.

보통 모든 시약은 유통 기한 없이 사용할 수 있다고 생각합니다.

시약을 올바르게 보관해야 합니다. 일부는 균이나 곰팡이가 잘 번식할 수 있기 때문에 냉장 보관해야 합니다. 빛에 민감한 시약은 어두운 곳에 보관해야 합니다.

“모든 시약은 염색대 위 선반에 보관합니다. 간혹 절편에서 미생물이 발견되는 경우도 있습니다.”

프로토콜을 정확하게 따르십시오.

직원들이 동일한 프로토콜을 사용함에도 다른 결과를 얻을 수 있습니다.

사용 중인 방법에서 벗어난 모든 사항을 기록합니다.

때때로 결과가 좋지 않을 때 프로토콜 변경 사항을 기록하지 않으면 그 이유를 알아내기가 어렵거나 불가능합니다.

세척 단계에 특히 주의를 기울이십시오. 예상과 다른 결과의 원인이 되는 경우가 많으므로 세척 단계를 최대한 표준화해야 합니다.

강한 거품이나 진동을 사용하거나 순한 용액을 사용하는 등 연구실 직원들마다 다른 세척 방법을 사용합니다.

탈색(감별) 단계와 같이 중요 단계에서 현미경을 조정해야 합니다. 현미경 설정이 커버 글라스를 씌우지 않은(젖은) 상태에서 절편의 모양에 미치는 영향에 주의해야 합니다. 잘못된 배경 염색이 나타날 수 있습니다.

어떤 염색 방법을 사용하든 육안으로 슬라이드를 보면서 염색 상태를 확인해야 합니다.

더 나은 조직학을 위한 101단계 지금 다운로드 받으세요