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일상 및 특수 염색 소개

James Anderson Global Marketing Manager
Geoffrey Rolls BAppSc, FAIMS

일반 H&E 염색과 특수 염색은 조직 진단 또는 연구에 중요한 역할을 합니다. 투명한 조직 절편을 염색함으로써 경험이 풍부한 병리학자와 연구원들이 현미경으로 조직 형태(구조)를 살펴보거나 특정 세포 유형, 구조 또는 박테리아와 같은 미생물의 존재나 유병률을 확인할 수 있습니다.

조직병리학 실험실에서 사용하는 “일반 염색”이라는 용어는 조직의 기본 구조 및 상태를 살펴보기 위해 모든 조직 표본에 “일상적으로” 사용되는 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E)을 지칭합니다. “특수 염색”은 H&E를 통해 병리학자 또는 연구자가 필요로 하는 모든 정보를 알 수 없을 때 사용하는 다수의 대체 염색 방법을 지칭하는 용어로 사용되고 있습니다.

염색을 위한 조직 준비

조직을 염색하여 살펴보기 전에 세포 하나의 두께 정도되는 매우 얇은 절편으로 절단하여 현미경 슬라이드에 놓을 수 있도록 준비해야 합니다. 조직을 고정(조직 손상 방지)시킨 다음 매우 얇은 두께(일반적으로 2~7µm)로 절단할 수 있도록 경화시키고 조직 내 공간을 채워야 합니다. 이를 위해 사용되는 두 가지 주요 기법은 동결 절편과 파라핀 포매 절편이라고 합니다.

동결 절편은 일반적으로 외과 의사가 종양 제거 수술 중에 절제면을 빠르게 알아야 할 때 사용됩니다. 신속하게 절편을 만들 수는 있지만, 파라핀을 이용한 방법만큼 품질이 좋지는 않습니다. 동결 절편 준비 과정은 다음과 같습니다.

  1. 조직을 보존하고 경화시키기 위해 빠르게 냉동시킵니다.
  2. 동결된 조직은 저온 유지 장치(동결실에 있는 절단 마이크로톰)에서 절단한 후 현미경 슬라이드 위에 놓고 염색을 합니다.
  3. 절편이 부서지지 않도록 단단히 고정한 후 염색합니다.

파라핀 절편을 준비할 때, 먼저 고정액으로 표본을 보존한 다음 파라핀 왁스로 표본을 침윤시켜 조직 구조를 단단하게 만듭니다. 이 과정은 동결 절편보다 시간이 더 오래 걸리지만 대부분의 경우 염색된 조직의 품질이 더 좋기 때문에 결과 샘플(블록)을 거의 영구적으로 보관할 수 있습니다. 파라핀 절편 준비 과정은 다음과 같습니다.

  1. 고정은 조직을 보존하는 과정입니다(일반적으로 포름알데히드 용액)사용).
  2. 육안검사는 절편을 만들 조직의 특정 영역을 분리하는 과정입니다
  3. 조직 처리는 시약을 사용하여 친수성 환경을 소수성 환경으로 바꿔 조직 구성 요소를 파라핀 왁스에 침윤시키는 과정입니다.
  4. 포매는 표본의 방향을 설정하고, 절편 절단 및 보관을 위해 왁스를 표본 안에 침투시켜 단단하게 경화시키는 과정입니다.
  5. 마이크로톰에서 미세한 두께로 조직을 절단한 다음 물에 띄워 현미경 슬라이드로 건져 올려 놓습니다.
  6. 그런 다음 수분을 제거하고 조직이 슬라이드에 잘 달라붙도록 슬라이드를 오븐이나 따뜻한 접시 위에 올려서 건조시킵니다.
  7. 이제 슬라이드에 올려놓은 조직을 염색할 준비가 되었습니다.
  8. 첫 번째 염색 단계는 왁스를 제거하는 과정으로 염색 전에 용매를 사용하여 슬라이드에서 왁스를 제거합니다. 이 작업은 항상 염색 과정의 일부로 수행됩니다. 염색이 끝나면 절편을 커버 글라스로 덮어서 영구 보관합니다.
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A microtomist creating a “ribbon” of very thin sections for staining
그림 1: 염색을 위해 “띠”처럼 매우 얇은 절편이 만들어진 모양

일반적으로 H&E 염색을 사용하는 이유

헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 병리학자/연구원들이 조직에 대한 매우 상세한 정보를 얻을 수 있어 조직병리학 실험실에서 가장 많이 사용하는 염색 방법입니다. 이 염색법을 통해 세포질, 핵, 세포 기관 및 세포외 기질을 포함하여 세포 구조를 확연하게 구분할 수 있습니다. 이 정보는 종종 세포의 구성(또는 해체)에 기반하여 질병 진단의 충분한 가능성을 제공하며, 또한 실제 세포의 이상이나 특정 지표(예, 암에서 일반적으로 관찰되는 핵 변화)를 관찰할 수 있게 합니다. 고급 염색법을 사용하더라도 H&E 염색은 병리학자/연구원들이 고급 염색을 올바르게 해석할 수 있는 기초적인 조직 형태학을 보여주기 때문에 진단 시 중요한 정보를 제공합니다.

임상 조직학 실험실의 모든 검체는 먼저 H&E으로 염색을 한 다음 두 가지 형태가 유사한 암을 구별하기 위한 경우처럼 더 상세한 분석을 위해 추가 정보가 필요한 경우에만 특수 염색 또는 고급 염색을 수행합니다

필요한 H&E 염색 양을 정확하게 결정해야 하므로 이제 대부분의 임상 실험실에서는 100% 자동화된 시스템을 사용하며, 수동 염색 방법을 사용하는 경우는 매우 드뭅니다.

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This section from the mucosa of small intestine shows well-defined heterochromatin and nucleoli in epithelial cells and plasma cells within the lamina propria
그림 2. 소장의 점막에서 채취한 절편으로 점막 고유층에 있는 상피 세포와 형질 세포의 이질 염색질과 핵소체가 명확하게 구분됩니다.
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Mitotic figures are sharply stained within the glandular epithelium in a section of small intestine
그림 3. 소장 절편의 선상피 내에 있는 유사분열상이 뚜렷하게 염색되어 있습니다.
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In this field from the lamina propria of small intestine, the cytoplasm of plasma cells has stained with hematoxylin except for the pale peri-nuclear area, which corresponds with a well-developed Golgi apparatus
그림 4. 소장 점막의 고유층에 있는 이 부분은 혈장 세포의 세포질이 옅은 핵 주변 지역을 제외하고 헤마톡실린으로 선명하게 염색되어 있으며, 잘 발달된 골지체에 해당합니다.
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This autonomic ganglion from the myenteric plexus, located between the smooth muscle layers of the muscularis externa of the small intestine, contains ganglionic nurones that show well-defined basophilic Nissl substance (aggregations of endoplasmic reticu
그림 5. 소장의 근외측 평활근층 사이에 위치한 근층간신경총에 있는 이 자율 신경절에는 세포질에 호염기성 Nissl 물질(소포체 및 리보솜 리보 핵산의 응집)이 명확하게 보이는 신경절 뉴련이 있습니다.

H&E 화학적 특성

H&E 염색은 헤마톡실린과 에오신 이렇게 두 가지 염료를 사용합니다. 이 조합은 서로 다른 조직 구성 요소를 염색할 때 사용됩니다.

헤마톡실린은 염기성 염료처럼 자줏빛 청색으로 반응합니다. 세포핵(DNA와 핵단백질)과 리보솜과 같은 RNA, 조면소포체가 있는 세포 기관 등 산성 또는 염기성 구조를 염색합니다.

에오신은 산성 염료로 붉은색 또는 분홍색으로 반응합니다. 이는 세포질, 세포벽, 세포외 섬유를 포함하는 염기성 또는 호산성 구조를 염색합니다.

염료 추출

헤마톡실린은 로그우드에서 추출하여 정제합니다. 산화 과정을 거쳐 매염제(일반적으로 알루미늄)와 혼합되면 세포 구조에 결합할 수 있게 됩니다. 조직학에서 사용되는 다양한 헤마톡실린 준비 과정 중에 길(Gill)과 해리스(Harris), 메이어(Mayer) 헤마톡실린이 가장 많이 사용되고 있습니다.

에오신은 브롬과 플루오레세인의 반응으로 형성됩니다. 조직학에서 일반적으로 사용되는 에오신 용액은 약간 노란빛을 띄는 에오신 Y와 약간 파란빛을 띄는 에오신 B 이렇게 두 가지 종류가 있습니다. 에오신 Y가 가장 많이 사용됩니다.

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Hematoxylin chemical structure
그림 6: 헤마톡실린 화학 구조
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Eosin Y chemical structure
그림 7: 에오신 Y 화학 구조

특수 염색

특수 염색이라는 용어는 보통 H&E를 제외한 모든 염색법을 가리킵니다. 특정 조직 구조, 구성 요소뿐만 아니라 H&E 염색으로 식별이 불가능한 미생물을 시각화하는 데 사용되는 다양한 방법을 아우르는 개념입니다.

다른 염색 방법은 면역 조직화학법 또는 동소교합법을 사용하여 특정 단백질 또는 DNA/RNA 서열을 표적으로 합니다. 이러한 방법은 “특별 염색” 범위에 포함시키기도 했지만 방법과 목적이 상당히 다르기 때문에 이제는 “고급 염색”이라는 세 번째 범주로 분리하고 있습니다.

모든 목적에 따라 수백 가지가 넘는 특수 염색 방법이 존재하지만, 임상 조직학에서는 주로 몇 가지 방법만을 사용하고 있습니다. 특수 염색은 그 방법이 다양하기 때문에 H&E 염색처럼 자동화되지는 않았습니다. 많은 대규모 실험실에서 자동화된 장비를 사용하고 있지만 일부는 직접 염색을 하는 경우도 있습니다. 일부 염색은 그 과정이 복잡해 자동화 장비의 사용이 비효율적일 수 있습니다.

가장 많이 사용되는 특수 염색

아래 이미지는 가장 많이 사용되는 특수 염색과 그 적용 사례입니다.

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The Masson’s Trichrome Stain Kit is intended for use in histological observation of collagenous connective tissue fibers in tissue specimens. It is used to assist in differentiating collagen and smooth muscle in tumors and assists in the detection of di
그림 8: 매슨(Masson) 트리크롬(피부). 이 염색법은 조직 표본에서 콜라겐 결합 조직 섬유를 조직학적으로 관찰하기 위해 사용합니다. 종양에서 콜라겐과 평활근을 구별하고 질병 또는 결합/근육 조직의 변화를 감지하는 데 사용됩니다.
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The Modified GMS Silver Stain Kit is intended for use in histological observation of fungi, basement membrane and some opportunistic organisms such as pneumocystis carinii in tissue specimens.
그림 9: 변형 GMS 염색(왼쪽: 폐포자충, 폐)(오른쪽: 아스페르길루스 감염, 폐). 변형 GMS 염색은 조직 검체에서 진균, 기저막 및 일부 기회주의적 유기체(예: 주폐포자충)를 조직학적으로 관찰하는 데 사용됩니다.
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Periodic Acid Schiff (PAS) staining is mainly used for staining structures containing a high proportion of carbohydrates such as glycogen,glycoproteins, proteoglycans typically found in connective tissues, mucus and basement membranes. Often used to stain
그림 10: PAS 염색(신장). PAS 염색은 보통 결합 조직, 점액 및 기저막에서 발견되는 글리코겐, 당단백, 프로테오글리칸 같이 탄수화물 비율이 높은 구조를 염색하는 데 주로 사용됩니다. 신장 생검, 간 생검, 횡문근의 특정 당원 축적 질환, 곰팡이 감염이 의심되는 절편 염색에 종종 사용됩니다.
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Perls’ Prussian Blue Iron stains are used to detect and identify ferric (Fe3+) iron in tissue preparations, blood smears,or bone marrow smears. Minute amounts of ferric acid are commonly found in bone marrow and in the spleen. Abnormal amounts of iron c
그림 11: 펄스 프러시안블루 철 염색(간). 철 염색은 조직 표본, 혈액 도말표본 또는 골수 도말표본에서 3가철(Fe3+) 이온을 검출 및 식별하는 데 사용됩니다. 3가철 이온(헤모시데린)은 보통 골수 및 비장에서 미량 존재합니다. 철분이 비정상적으로 많으면 혈색증 및 혈철증을 나타낼 수 있습니다.
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Acid Fast Bacillus stains are used to detect and identify acid fast bacilli in tissue. Bacilli are rod-shaped bacterial organisms. A primary function of this stain is to identify tuberculosis in lung tissue, as well as other bacterial bacillus infected ti
그림 12: 지일 닐센 염색(항산균, 폐). 이 염색은 조직 내 항산균을 검출하고 식별하는 데 사용됩니다. 바실루스는 막대 모양의 세균입니다. 이 염색의 주요 기능은 폐 조직에서 결핵을 식별하는 것입니다.
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Alcian Blue is normally prepared at an acidic pH of 2.5 and is used to identify acid mucopolysaccharides and acetic mucins. Excessive amounts of non-sulfated acidic mucosubstances are seen in mesotheliomas, certain amounts occur normally in blood vessel w
그림 13: 알리샨 블루 염색(내장). 알리샨 블루(Alcian Blue)는 보통 pH 2.5로 조제되며, 산성 뮤코다당류 및 아세트산 뮤신을 확인하는 데 사용됩니다. 중피종에서는 과도한 양의 비황산화 산성 점액물질이 나타나며, 보통 일정한 양이 혈관벽에서 발생하지만 죽상동맥경화증의 초기 병변에서 증가합니다.
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Alcian Blue and PAS combines the properties of both Alcian Blue and Periodic Acid Schiff staining.
그림 14: 알리샨 블루 및 PAS 염색(내장). 알리샨 블루와 PAS 염색의 특성을 결합한 염색 방법입니다.
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Gomori Trichrome (blue) (submucosa). Trichrome stains are used to stain and identify muscle fibers, collagen and nuclei. They can be used to contrast skeletal, cardiac or smooth muscle. The Gomori Trichrome is a simplification of the more elaborate Masson trichrome stain and combines the plasma stain (chromotrope 2R) and connective tissue stain to provide a brilliant contrasting picture.
그림 15: 고모리 트리크롬 블루 염색(점막하 조직). 트리크롬 염색은 근섬유, 콜라겐 및 핵을 염색하고 식별하는 데 사용됩니다. 이 방법은 골격, 심장 또는 평활근을 대조하는 데 사용할 수 있습니다. 고모리 트리크롬(Gomori Trichrome)은 보다 정교한 매슨 트리크롬 염료를 단순화한 형태이며, 플라즈마 염색(chromotrope 2R) 및 결합 조직 염색을 조합하여 더 선명한 대비 효과를 얻을 수 있습니다.
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Gomori Trichrome (green) (submucosa). Trichrome stains are used to stain and identify muscle fibers, collagen and nuclei. They can be used to contrast skeletal ,cardiac or smooth muscle. The Gomori Trichrome is a simplification of the more elaborate Masson stain and combines the plasma stain (chromotrope 2R) with the connective tissue stain to provide a brilliant contrasting picture.
그림 16: 고모리 트리크롬 그린 염색(점막하 조직). 트리크롬 염색은 근섬유, 콜라겐 및 핵을 염색하고 식별하는 데 사용됩니다. 이 방법은 골격, 심장 또는 평활근을 대조하는 데 사용할 수 있습니다. 고모리 트리크롬(Gomori Trichrome)은 보다 정교한 매슨 염료를 단순화한 형태이며, 플라즈마 염색(chromotrope 2R)을 결합 조직 염색과 조합하여 더 선명한 대비 효과를 얻을 수 있습니다.

특수 염색 개선 단계

라이카 바이오시스템즈의 비전은 암 진단 방법을 개선하여 삶의 질을 높이는 데 있습니다. 이를 위한 한 가지 방법으로 염색 품질을 개선해 나가고 있습니다. IHC와 IHC 품질은 염료에서 시작되지 않는다는 사실을 잘 알고 있기 때문에 이 시리즈에서는 염색 품질의 다양한 측면을 깊이 살펴보고 향후 테스트가 진단 개선에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지 고찰해봅니다.

단계 - 염색 이해

수행하는 염색을 통해 무엇을 입증하고자 하는지 파악합니다.

단순히 “방법만 따르고” 완성된 절편에서 무엇을 보고자 하는지 잘 모른다면 원하는 결과를 얻을 수 없습니다

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Understand the Stain
A는 PAS로 염색한 간 절편입니다. 리포푸신과 글리코겐은 PAS 양성이며, 담즙과 헤모시데린은 PAS 음성으로 자연색(각각 노란색과 갈색)으로 나타납니다. B 절편은 그로콧-고모리 방법으로 염색한 폐의 기회주의적 균성 감염(아스페르길루스)을 보여줍니다. 진균성 균사는 깨끗한 탄소와 같은 검정색으로 흡연자들과 대부분의 도시 거주자들의 폐에서 공통적으로 나타나는 특징입니다.

단계 - 양성 대조군 사용

항상 증명하고자 하는 구조/물질이 들어 있는 것으로 알려진 대조군 슬라이드를 사용하십시오.

“염색 중인 구조/물질이 슬라이드에서 보이지 않는다면 해당 구조/물질이 존재하지 않는다고 가정합니다.”

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Use a Positive Control
(파란색)에서 철 함유 헤모사이더를 입증하는 Perl의 방법으로 염색된 간경변성 간의 부분. 이는 철 염색에 대한 만족스러운 양성 대조군이 될 것이다.

단계 - 정확한 시간 적용

정확한 시간을 적용하십시오.

시간은 항상 근사치입니다. 부정확한 시간은 일관성 없는 결과를 낳습니다.

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Use Accurate Timing
동일한 블록에서 채취한 피부 절편으로 모두 PAS 방법으로 염색했습니다. 절편 A는 5분 동안 과요오드산(산화 단계)으로 처리하고, 절편 B는 실수로 30초만 처리했습니다. 그 결과, 절편 B에서 기저막이 매우 형편없이 염색되었습니다.

단계 - 시약 안정성 고려

사용 중인 시약의 유통 기한을 확인하십시오. 매우 불안정하고, 서서히 변질되므로 항상 새로 만들어 즉시 사용해야 합니다. 시약에 따라 사용하기 전에 산화(숙성) 과정을 위해 일정 시간 동안 방치해 두어야 합니다.

보통 모든 시약은 유통 기한 없이 사용할 수 있다고 생각합니다.

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Consider Reagent Stability
과산화된 Muddy Weigert의 헤마톡실린. 갈색으로 염색된 콜라겐을 보십시오.

단계 - 올바른 시약 보관

시약을 올바르게 보관해야 합니다. 일부는 균이나 곰팡이가 잘 번식할 수 있기 때문에 냉장 보관해야 합니다. 빛에 민감한 시약은 어두운 곳에 보관해야 합니다.

“모든 시약은 염색대 위 선반에 보관합니다. 간혹 절편에서 미생물이 발견되는 경우도 있습니다.”

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Store Reagents Correctly
이 절편에서는 염색 용액(이 경우 헤마톡실린)에서 번식한 다음 절편 위에 축적된 다량의 외부 미생물을 확인할 수 있습니다.

단계 - 방법 준수

프로토콜을 정확하게 따르십시오.

직원들이 동일한 프로토콜을 사용함에도 다른 결과를 얻을 수 있습니다.

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Adhere to the Method
매슨 트리크롬 염료로 염색한 포르말린 고정 점막하 절편입니다. 절편 A는 붉은색 평활근입니다. 이 경우, 실험실 염색 프로토콜에 따라 사전 크롬산 단계(감작 또는 2차 매염)를 포함하여 정확하게 수행되었습니다. 절편 B를 염색할 때 이 단계를 건너뛰었습니다. 절편 B(내장)에서는 근육의 감별을 위한 착색이 부족합니다.

단계 - 변경 사항 기록

사용 중인 방법에서 벗어난 모든 사항을 기록합니다.

때때로 결과가 좋지 않을 때 프로토콜 변경 사항을 기록하지 않으면 그 이유를 알아내기가 어렵거나 불가능합니다.

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Record Any Changes
여기 보이는 레티큘린 섬유증에 대한 은 염색은 결과가 선명하지 않으며 슬라이드 배경에 거품(침전물)이 있습니다. 방법을 정확하게 따르지 않은 경우(Gordon & Sweets 방법, 신장) 문제의 원인을 파악하기가 매우 어렵습니다.

단계 - 세척 단계 표준화

세척 단계에 특히 주의를 기울이십시오. 예상과 다른 결과의 원인이 되는 경우가 많으므로 세척 단계를 최대한 표준화해야 합니다.

강한 거품이나 진동을 사용하거나 순한 용액을 사용하는 등 연구실 직원들마다 다른 세척 방법을 사용합니다.

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Standardize Washing Steps
이 간 절편은 모두 동일한 방법으로 염색했습니다. 유일한 차이점은 침투 및 환원 사이에 절편을 다른 방법으로 헹구었습니다. 절편 A(Gordon & Sweets 방법)의 레티큘린 섬유는 검정색이며 더 선명하게 보입니다.

단계 - 현미경을 신중하게 설정

탈색(감별) 단계와 같이 중요 단계에서 현미경을 조정해야 합니다. 현미경 설정이 커버 글라스를 씌우지 않은(젖은) 상태에서 절편의 모양에 미치는 영향에 주의해야 합니다. 잘못된 배경 염색이 나타날 수 있습니다.

어떤 염색 방법을 사용하든 육안으로 슬라이드를 보면서 염색 상태를 확인해야 합니다.

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Set Up Microscope Carefully
콘덴서 조리개를 닫은 상태에서 현미경으로 관찰한 젖은 절편 A(커버 글라스 없음). 잘못된 배경에 주목합니다. 콘덴서 조리개를 연 상태에서 현미경으로 관찰한 젖은 절편 B(커버 글라스 없음). 선명한 배경에 주목합니다.

발표자 소개

James Anderson , Global Marketing Manager

James Anderson is a Global Marketing Manager at Leica Biosystems with experience with histology and scientific, technical, and marketing communications.

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.

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