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절편 제작 개요: 파라핀 포매 조직 전처리 및 박절

Geoffrey Rolls BAppSc, FAIMS

파라핀 포매 조직 전처리 및 박절

회전식 마이크로톰을 사용하여 좋은 파라핀 절편을 만들기 위해서는 다양한 기술과 경험이 필요합니다. "절편 제작 및 파라핀 절편 전처리"는 절편 제작 초보자를 위한 훌륭한 교육 자료이며 이 자료를 숙련된 연구원을 위한 효과적인 재교육 자료로 활용할 수도 있습니다. 파라핀 절편 박절의 모든 필수 측면을 다루며 주요 내용은 다음과 같습니다:

  • 안전
  • 마이크로톰 준비
  • 마이크로톰 블레이드
  • 블록 다듬기, 전장(facing) 및 러핑(roughing)
  • 일관된 파라핀 절편 제작 기법
  • 마이크로톰 유지 관리
  • 일반적인 절편 제작 오류

보다 나은 절편 제작 + 부유 + 절편 건조 단계

병리학자의 조직학적 검사를 위해 환자의 조직 표본을 전처리 하는데는 세심한 주의, 역량 및 완벽한 절차가 필요합니다. 이 가이드에서는 실제 모범 사례와 일반적인 오류를 방지할 수 있는 간단한 방법을 설명합니다.

이번 가이드에서는 보다 나은 절편 제작 + 부유 + 절편 건조를 위한 팁을 중점적으로 소개합니다. 각 단계에서는 우수한 조직학 검사에 중요한 정보를 제공하고 허용할 수 없는 결과가 발생하는 경우 이러한 단계를 통해 문제를 해결할 수도 있습니다.

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고품질 블레이드 사용

항상 박절에 날카로운 고품질 블레이드를 사용합니다.

가능한 오랫동안 블레이드를 사용합니다. 어느 정도의 "트레인 라인(train line)"은 문제가 되지 않습니다.

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Use High Quality Blades
A: 블레이드 결함으로 인해 가는 선이 많이 보이는 비장 절편 (H&E)
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고품질 블레이드 사용
B: 부유가 진행 중인 피부 절편 블레이드 선이 선명하게 조직을 관통하는 것을 알 고, 이러한 결함은 부유 과정에서 자주 나타남.

나이프 경사각 최적화

나이프 경사각은 항상 각각의 마이크로톰과 블레이드 유형에 맞게 최적화되어야 합니다.

조건이 변경되더라도(다른 마이크로톰, 새로운 블레이드 유형, 다른 왁스 등) 나이프 경사각은 조정되지 않습니다.

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나이프 경사각 최적화
차가운 블록에서 박절된 이 짧은 리본 모양의 절편은 상당히 압착된(30~40%) 상태로 보입니다. 이 경우 나이프 경사각을 재설정하면 문제가 해결됩니다.

블록 다듬기

조직이 노출되게 하려면 블록을 조심스럽게 다듬어야 합니다. 몇몇 최종 절편은 항상 최종 두께로 박절 되어 블록 표면이 연마됩니다.

조직을 적당히 다듬기 하면 시간을 절약할 수 있습니다. 그러나 최종 절편을 채취하기 전에 표면이 연마되지 않습니다. 이러한 경우 최종 절편은 작고 불규칙한 구멍이 가득 있는 "좀먹은 듯한" 모양으로 나타납니다.

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블록 다듬기
이 블록에서 조직이 처음 노출되면(러핑) 블록 표면에 단편이 나타났으며 그에 따라 최종 절편에 수많은 구멍이 생겼습니다(H&E).

동결 손상 주의

블록은 저온의 젖은 표면에서 냉각되며 항상 차가운 상태로 박절됩니다(녹는 얼음의 표면이 가장 바람직함).

블록은 동결된 후에 박절되며 이로 인해 블록에 균열이 생기는 경우가 있습니다.

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동결 손상 주의
이 블록 표면은 박절 전 냉동실에서 –15°C 온도로 냉동되었으므로 블록 표면에 균열이 생겼습니다. 균열이 생기면 왁스가 더 이상 조직과 접촉하지 않아 박절과 부유가 어려워질 수 있습니다.

차가운 블록 사용

블록은 항상 차가운 상태로 박절됩니다.

블록에서 최종 절편이 박절될 때 지연이 발생하는 경우도 있습니다. 이 경우 블록이 따뜻해져 절편이 과도하게 압축될 수 있습니다.

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차가운 블록 사용
A 신장 절편이 박절될 때 과도하게 압축되어 사구체가 왜곡됨(H&E).
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차가운 블록 사용
B 부유가 진행 중인 같은 블록의 절편. 왼쪽 절편은 블록을 냉각시키지 않고 박절된 반면 오른쪽 절편은 블록이 냉각된 상태에서 박절됨

천천히 절편 박절

각 블록의 최종 절편을 균일한 속도로 천천히 회전시키면서 조심스럽게 박절합니다.

절편 압축 문제는 부양 수조에서 해결될 것이라 믿고 가능한 고속 회전으로 절편을 박절합니다.

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Cut Sections Slowly
A. 불안정한 조직의 차가운 블록을 너무 빨리 박절하여 미세한 금이 나타난 설치류 간(레티쿨린(reticulin) 염색). 이 경우 블록을 약간 데운 후 매우 천천히 박절하여 문제를 해결. 마이크로톰에서 파라핀 블록이나 블레이드가 단단히 고정되지 않은 경우에도 금이 생길 수 있음.
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천천히 절편 박절
B 아주 차가운 블록을 너무 빠르게 박절하여 H&E로 염색한 이 점막 조직의 절편에 미세한 금이 보임.

깨끗한 물 사용

부양 수조의 물을 정기적으로 교체합니다.

부양 수조의 물을 정기적으로 보충하되 가끔씩만 교체합니다. 수조에 오염 물질이 있으면 절편 아래 슬라이드에 나타날 수 있습니다(균류, 곰팡이 등).

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Use Clean Water
위장 기관 장막 절편(H&E). 약하게 염색된 미생물 군집이 조직 내에 있지만 절편 외부 슬라이드 위에서도 보일 수 있습니다. 이러한 오염 유기체의 가능한 원인은 부양 수조입니다.

슬라이드 청결 유지

슬라이드를 사용하기 전에 항상 슬라이드 청결 상태를 확인합니다. 슬라이드 접촉을 최소화하면 부유 전 편평 세포로 인한 오염을 방지할 수 있습니다.

슬라이드 청결 상태를 확인하지 않습니다. "염색 과정에서 절편이 슬라이드 위에만 있으면 괜찮습니다. " 깨끗한 슬라이드라도 먼지, 유기체 및 다른 오염 물질로 인해 오염될 수 있습니다.

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슬라이드 청결 유지
A. 이 신장 절편은 사용 전에 슬라이드에 있던 검은색 물질로 인해 오염됨. 슬라이드 다른 부분의 절편 아래에 침전물이 보임.
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Ensure Slides are Clean
B. 절편이 건조될 때 형성되어 염색된 점착제 "풀(pool)"이 있는 폐 절편. 이 점착제(일반적으로 젤라틴 성분)는 부양 수조에 있었습니다. 수분이 증발하면서 점착제의 단백질 성분이 농축됨. 건조 전에 절편의 수분을 올바르게 제거하면 문제가 발생하지 않을 수 있음.

교차 오염 방지

표본을 교체할 때마다 수면의 이물질을 걷어 내면 세포가 있는 절편이 다른 절편으로 인해 오염되는 것을 방지할 수 있습니다.

블록을 교체할 때마다 수면의 이물질을 걷어 내지 않습니다. 이 경우 표본 간 교차 오염이 발생하여 혼란이 야기되고 진단 결과까지 부정확해질 수 있습니다.

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교차 오염 방지
다른 케이스의 갑상선 단편으로 인해 심근 절편이 오염되었습니다. 이 표본 교차 사례는 부양 수조에서 발생했습니다.

각질로 인한 오염 방지

절편을 부양할 때 머리카락을 만지거나 손을 비비지 않도록 주의합니다. 피부 각질로 인해 절편이 오염될 수 있습니다.

"몇몇 연구원이 만든 슬라이드에 각질이 많이 포함되었습니다. 그들은 이 문제를 방지할 수 있다는 사실을 잘 모르는 것 같습니다."

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각질로 인한 오염 방지
절편이 부양 수조에 있을 때 절편 표면에 많은 외부 각질이 쌓여 오염된 신장 절편. 각질이 단단히 점착된 후 에오신에 염색됩니다.

개별 블록 부유

부양 수조에서 블록(케이스) 두 개 이상의 절편을 동시에 부유하지 않습니다.

블록(케이스) 두 개 이상의 절편이 동시에 부유 상태가 되는 경우가 있습니다. 이 경우 표본을 정확하게 동정하지 못하는 위험한 상황이 발생합니다. 절편이 같은 유형의 표본에서 생성되는 경우에 특히 위험합니다.

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개별 블록 부유
여기서는 두 가지 다른 케이스의 절편이 동시에 부유된 상태입니다. 이 경우 혼란이 발생할 수 있으며 절편을 정확하게 동정하지 못할 수 있습니다.

수온 점검

부양 수조 온도를 주의 깊게 점검합니다. 최적의 온도는 왁스 용해점보다 4~5°C 낮은 온도입니다. 절편이 쉽게 평탄화되어야 하지만 왁스가 녹아서는 안 됩니다.

절편이 부양 수조에 15초 이상 있으면 왁스가 녹습니다. 처리 속도가 더 빨라지는 것처럼 보이지만 과도한 고속 팽창으로 인해 조직과 세포가 손상될 수 있습니다.

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수온 점검
이 피부 절편에서는 균열과 과도한 층 분리가 명확하게 나타나며 이는 과도한 팽창에 따른 일반적인 결과입니다. 조직을 잘못 처리하면 이와 같은 문제가 발생할 가능성이 높습니다.

절편 주름 방지

양 수조에서 절편이 잘 평탄화됩니다.

부양 수조에서 절편이 평탄화되지 않습니다. 수조 온도가 너무 낮고 슬라이드에 절편을 올려 놓을 때 절편에 주름이 있을 수 있습니다.

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절편 주름 방지
이러한 경우는 절편 박절으로 인해 생긴 주름이 부유 과정에서 평탄화되지 않은 것입니다. 보다 우수한 박절 기법과 수조 수온을 약간 더 올리면 이 문제가 해결됩니다.

과도한 절편 팽창 방지

절편이 평탄화될 때까지만 부양 수조에 담그고 슬라이드에 즉시 올려 놓습니다.

편의상 절편 일부를 부양 수조에 장시간 담가둡니다. 이 경우 과도한 팽창으로 인해 조직이 손상될 수 있습니다.(특히 림프 조직과 같은 민감한 표본의 경우).

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Avoid Over-expanding Sections
A. PAS로 염색한 장점막 절편에 과도하게 팽창된 현상이 나타납니다(창자샘에서 과도하게 분리됨). 이 경우 고온의 수조에서 절편이 너무 오랫동안 부유된 상태
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Avoid Over-expanding Sections
B. 부양 수조에서의 과도한 팽창으로 인해 균열이 생긴 림프 조직 절편. 특히 림프 조직과 조혈 조직이 이렇게 손상되기 쉬움.

부유 절편 손상 방지

브러시나 겸자를 사용하여 부유 상태인 절편의 주름을 제거할 때 세심한 주의를 기울입니다.

브러시나 겸자를 사용하여 부유 상태인 절편의 주름을 제거합니다. 이 경우 눈에 보이는 손상은 물론 보이지 않는 손상도 쉽게 발생할 수 있습니다.

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부유 절편 손상 방지
심근 절편에 나타난 물리적 손상(구멍)입니다. 절편에서 접힌 부분을 제거하려고 하다가 생긴 구멍입니다(심장, H&E).

신중한 절편 선택

여러 절편 중에서 첫 번째나 두 번째 절편을 사용해서는 안 됩니다.

여러 절편 중에서 다른 절편보다 좋아 보이는 첫 번째나 두 번째 절편을 선택합니다. 이러한 절편이 더욱 좋아 보이는 이유는 나이프를 처음 두 번 통과할 때 차가운 블록이 확장되어 더 두꺼워지기 때문입니다.

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신중한 절편 선택
박절된 순서에 따라 이 블록으로 전처리한 절편 여러 개에 번호를 지정합니다. 처음 두 절편이 가장 넓지만(압축이 가장 적음) 블록 온도가 올라가면 절편이 좁아집니다(압축 증가). 마이크로톰은 3 µm로 설정되었지만 열 팽창으로 인해 처음 두 절편의 두께는 4~5 µm입니다.

절편 아래 기포 생성 방지

부양 수조 안에 기포가 생기기 않도록 주의합니다. 절편을 물에 담그기 전에 보이는 기포를 제거합니다.

부양 수조 내 작은 기포를 무시합니다. 절편 아래에 있는 기포는 절편을 건조하면 눈에 띄게 사라집니다. 기포가 안보이더라도 절편에서 기포 위에 있는 부분이 왜곡되는 경우가 많으며 이 경우 염색 중에 부풀어 오를 수 있습니다.

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Prevent Bubbles Under Sections
H&E로 염색한 간 절편으로, 균열이 생긴 둥근 부분은 절편이 들어 올려진 위치입니다. 원인은 부양 과정에서 절편 아래에 기포가 생성되어 절편이 올바르게 평탄화되거나 점착되지 않았기 때문입니다.

절편 리프팅 방지

"점착식"(전하를 띈) 슬라이드 또는 AAS와 같은 절편 점착제 사용을 고려하고 적절하게 사용합니다.

염색 중에 절편이 부풀어 오르는 경우가 있습니다(특히 IHC 의 항원 회복 과정에서 또는 방법상 열을 사용해야 하는 경우). 이러한 경우에는 전하를 띈 슬라이드 또는 절편 점착제가 필요합니다

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절편 리프팅 방지
이 슬라이드에는 절편이 들떠 인접한 조직에 침전된 부위가 나타납니다(폐, H&E).

건조 전 물기 제거

 절편을 슬라이드 건조기나 핫플레이트에 올려 놓기 전에 잠시 물기를 제거합니다.

 절편의 물기를 올바르게 제거하지 않고 수평 방향으로 건조시켰습니다. 절편이 슬라이드 위에서 움직이고 간혹 평평하게 건조되지 않습니다.

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Drain Before Drying
A. 이 절편은 사전에 효과적으로 물기를 제거하지 않고 수평 방향으로 건조되었습니다. 결과적으로 중앙에 초점이 맞지 않는 돌출된 영역이 나타납니다.
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Drain Before Drying
B. 이 절편은 부양 수조에서 방금 가져온 절편이며 잠시 수직 방향으로 물기를 제거한 후 슬라이드 건조기에 올려 놓습니다. 이 방법을 사용하면 A와 같은 문제를 방지할 수 있습니다.

건조 온도 모니터링

슬라이드 건조기의 온도를 주의 깊게 모니터링합니다.

슬라이드 건조기는 간혹 매우 뜨겁습니다. 온도가 너무 높으면 절편에 핫스팟이 생성되어 균일하게 염색되지 않을 수 있습니다.

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Monitor Drying Temperature
이 전립선 절편에는 "핵 용융"의 특징이 나타나며, 슬라이드 건조 시 과도한 열에 의해 발생할 수 있습니다. 조직 처리를 잘못하면 이와 비슷한 결과가 발생할 수 있습니다. 핵 용융은 일반적으로 표본 주위에 나타나며 대개 상피 조직에 영향을 줍니다. 핵이 균일하게 염색되지 않아 분홍색 또는 선명한 파란색으로 표시될 수 있으며 이 경우 상세 정보를 얻을 수 없습니다.

적절한 건조 시간

최소 및 최대 슬라이드 건조 시간을 모니터링합니다.

슬라이드 건조 시간의 차이가 큽니다. 고온에서 장시간 건조하면 절편이 나쁜 영향을 받을 수 있습니다.

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적절한 건조 시간
H&E로 염색한 림프 절편으로, 고온에서의 장시간 건조로 인해 많은 균열이 생겼습니다. 이러한 균열은 과도한 처리 등 다른 요인으로 인해 나타날 수도 있습니다.

발표자 소개

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.

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