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Una introducción a la tinción rutinaria y especial

James Anderson
James Anderson Global Marketing Manager
Geoffrey Rolls
Geoffrey Rolls BAppSc, FAIMS

La tinción de rutina con H&E y las tinciones especiales desempeñan un papel fundamental en el diagnóstico o la investigación basados en tejidos. Al colorear secciones de tejido transparentes, estas tinciones permiten a patólogos e investigadores altamente cualificados ver, bajo un microscopio, la morfología del tejido (estructura) o buscar la presencia o prevalencia de tipos de células particulares, estructuras o incluso microorganismos como bacterias.

En el laboratorio de histopatología, el término “tinción rutinaria” se refiere a la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) que se utiliza “de forma rutinaria” con todas las muestras de tejido para revelar las estructuras y condiciones tisulares subyacentes. El término “tinciones especiales” se ha utilizado durante mucho tiempo para hacer referencia a un gran número de técnicas de tinción alternativas que se utilizan cuando la técnica con H&E no proporciona toda la información que el patólogo o investigador necesita.

Preparación del tejido para la tinción

Antes de poder teñir y ver el tejido, debe prepararse de forma que una sección muy fina, de una sola célula de grosor, pueda cortarse y colocarse en un portaobjetos de microscopio. Esto implica fijar el tejido (para que no se descomponga) y luego endurecerlo y darle soporte para que pueda cortarse en secciones muy finas (normalmente de 2–7 μm). Para esto, se utilizan dos técnicas principales, denominadas secciones congeladas y secciones incluidas en parafina.

Las secciones congeladas se utilizan cuando se necesitan respuestas rápidas, normalmente durante una cirugía, cuando el cirujano necesita conocer el margen de escisión al extirpar un tumor. Su producción es rápida, pero normalmente no ofrecen la misma calidad de sección que la técnica de parafina. El proceso para la preparación de secciones congeladas es el siguiente:

  1. El tejido se congela rápidamente para ser conservado y endurecido.
  2. El tejido congelado se secciona en un criostato (un microtomo de corte en una cámara de congelación) y se coloca en una preparación de microscopio para su tinción.
  3. La sección se fija inmediatamente antes de que comience a descomponerse y, luego, se tiñe.

Cuando se preparan cortes de parafina, la muestra se conserva primero con un fijador y, a continuación, se da soporte a la estructura tisular infiltrando la muestra en parafina. El proceso requiere más tiempo que la creación de secciones congeladas, pero proporciona una tinción de mejor calidad en la mayoría de los casos y las muestras resultantes (denominadas bloques) se pueden almacenar casi indefinidamente. El proceso de corte en parafina es el siguiente:

  1. La fijación conserva el tejido (normalmente con una solución basada en formaldehído).
  2. El tallado aísla el área particular del tejido que se va a cortar.
  3. El procesamiento de tejidos utiliza una secuencia de reactivos para sustituir un entorno acuoso (basado en agua) por uno hidrófobo que permite infiltrar los elementos tisulares en parafina.
  4. La inclusión permite la orientación de la muestra y la fija en un bloque de parafina para el corte y almacenamiento de la sección.
  5. El corte se realiza en un microtomo que corta secciones muy finas que se hacen flotar en un baño de agua y luego se recogen y colocan en una preparación de microscopio.
  6. A continuación, las preparaciones se secan en un horno o en una placa calefactora para eliminar la humedad y ayudar a que el tejido se adhiera al portaobjetos.
  7. El tejido del portaobjetos ahora ya está listo para la tinción.
  8. El primer paso de la tinción es la eliminación de la parafina, para lo cual se utiliza un disolvente para eliminar la parafina de la preparación antes de la tinción. Esto siempre se hace como parte del proceso de tinción. Cuando se completa una tinción, la sección se cubre con un cubreobjetos que hace que la preparación sea permanente.
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Una introducción a la tinción rutinaria y especial
Figura 1: Un microtomista creando una “cinta” de secciones muy finas para la tinción

Por qué la tinción con H&E es rutinaria

La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) se utiliza de forma rutinaria en laboratorios de histopatología, ya que proporciona al patólogo/investigador una vista muy detallada del tejido. Esto se consigue mediante la tinción clara de estructuras celulares, incluido el citoplasma, el núcleo y los orgánulos y los componentes extracelulares. Esta información es a menudo suficiente para permitir un diagnóstico de enfermedad basado en la organización (o desorganización) de las células y también muestra cualquier anomalía o indicador particular en las células reales (como los cambios nucleares que normalmente se observan en el cáncer). Incluso cuando se utilizan métodos de tinción avanzados, la tinción H&E sigue formando una parte crítica del panorama diagnóstico, ya que muestra la morfología tisular subyacente que permite al patólogo/investigador interpretar correctamente la tinción avanzada.

En un laboratorio de histología clínica, todas las muestras se tiñen inicialmente con H&E y las tinciones especiales o avanzadas solo se solicitan si se necesita información adicional para proporcionar un análisis más detallado, por ejemplo, para diferenciar entre dos tipos de cáncer morfológicamente similares.

Debido al volumen de tinción de H&E necesario, la mayoría de los laboratorios clínicos utilizan sistemas totalmente automatizados y la tinción manual es hoy en día poco frecuente.

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Figura 2: Esta sección de la mucosa del intestino delgado muestra heterocromatina y nucléolos bien definidos en las células epiteliales y en las células plasmáticas de la lámina propia
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Figura 3: Las figuras mitóticas se tiñen nítidamente dentro del epitelio glandular en una sección del intestino delgado
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Figura 4: En este campo de la lámina propia del intestino delgado, el citoplasma de las células plasmáticas se ha teñido con hematoxilina, excepto el área perinuclear pálida, que se corresponde con un aparato Golgi bien desarrollado
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Figura 5: Este ganglio autónomo del plexo mientérico, situado entre las capas musculares lisas de la muscularis externa del intestino delgado, contiene neuronas ganglionares que muestran una sustancia basófila de Nissl bien definida (agregaciones de retículo endoplasmático y ARN ribosómico) en su citoplasma.

Química de la H&E

La tinción H&E utiliza dos colorantes: hematoxilina y eosina. Esta combinación se utiliza debido a que cada uno de estos colorantes tiñe diferentes elementos tisulares.

La hematoxilina reacciona como un tinte básico con un color azul púrpura. Tiñe la estructura ácida o basófila, incluido el núcleo celular (que contiene ADN y nucleoproteína) y los orgánulos que contienen ARN como los ribosomas y el retículo endoplasmático rugoso.

La eosina es un colorante ácido que normalmente da un color rojizo o rosa. Tiñe estructuras básicas, o acidófilas, que incluyen el citoplasma, las paredes celulares y las fibras extracelulares.

Fuentes de los colorantes

La hematoxilina se extrae de un árbol llamado palo de Campeche y se purifica. Luego se oxida y se combina con un mordiente (normalmente aluminio) para permitir que se una a las estructuras celulares. De las muchas preparaciones de hematoxilina utilizadas en la histología, la hematoxilina de Gill, la hematoxilina de Harris y la hematoxilina de Mayer son las más populares.

La eosina se forma por una reacción entre el bromo y la fluoresceína. Hay dos variantes de eosina que se utilizan habitualmente en histología: la eosina Y, que es ligeramente amarillenta, y la eosina B, que es ligeramente azulada. La eosina Y es la más popular.

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Figura 6: Estructura química de la hematoxilina
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Figura 7: Estructura química de la eosina Y

Tinciones especiales

El término “tinciones especiales” hace referencia tradicionalmente a cualquier tinción que no sea una H&E. Abarca una amplia variedad de métodos que pueden utilizarse para visualizar estructuras tisulares particulares, elementos o incluso microorganismos no identificados mediante tinción H&E.

Otros métodos de tinción utilizan inmunohistoquímica o hibridación in situ para dirigirse a proteínas específicas o secuencias de DNA/RNA. Estos métodos a veces también se han incluido en la familia de “tinciones especiales”. Sin embargo, son bastante diferentes en cuanto al método y la finalidad, y ahora se separan normalmente en una tercera categoría conocida como “tinciones avanzadas”.

Aunque, literalmente, hay cientos de tinciones especiales para todo tipo de fines, solo unos pocos se utilizan con regularidad en histología clínica. La variedad de tinciones también hace que la tinción especial no esté tan automatizada como la tinción H&E. Aunque muchos laboratorios de gran tamaño utilizan instrumentos automatizados para las tinciones más comunes, siguen teniendo un área para la tinción manual. La complejidad de algunas tinciones también impide el uso de la automatización.

Algunas tinciones especiales comunes

Las imágenes siguientes ilustran algunas de las tinciones especiales comunes y sus aplicaciones.

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The Masson’s Trichrome Stain Kit is intended for use in histological observation of collagenous connective tissue fibers in tissue specimens. It is used to assist in differentiating collagen and smooth muscle in tumors and assists in the detection of di
Figura 8: Tinción tricrómica de Masson (piel). Esta tinción está indicada en la observación histológica de fibras de tejido conjuntivo de colágeno en muestras de tejido. Se utiliza para ayudar a diferenciar el colágeno y el músculo liso en los tumores y a detectar enfermedades o cambios en el tejido conjuntivo/muscular.
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The Modified GMS Silver Stain Kit is intended for use in histological observation of fungi, basement membrane and some opportunistic organisms such as pneumocystis carinii in tissue specimens.
Figura 9: Tinción argéntica GMS modificada (izquierda: Pneumocystis, pulmón) (derecha: infección por Aspergillus, pulmón). La finalidad de uso de la tinción argéntica GMS modificada es la observación histológica de hongos, la membrana basal y algunos organismos oportunistas tales como el Pneumocystis carinii en muestras de tejido.
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Periodic Acid Schiff (PAS) staining is mainly used for staining structures containing a high proportion of carbohydrates such as glycogen,glycoproteins, proteoglycans typically found in connective tissues, mucus and basement membranes. Often used to stain
Figura 10: Ácido peryódico de Schiff (riñón). La tinción PAS se utiliza principalmente para el teñido de estructuras que contienen una alta proporción de carbohidratos tales como el glucógeno, las glucoproteínas, proteoglucanos que normalmente se encuentran en los tejidos conjuntivos, mucosas y membranas basales. A menudo se utiliza para teñir biopsias renales, hepáticas ciertas tesaurismosis del glucógeno en músculos estriados y presuntas infecciones micóticas.
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Perls’ Prussian Blue Iron stains are used to detect and identify ferric (Fe3+) iron in tissue preparations, blood smears,or bone marrow smears. Minute amounts of ferric acid are commonly found in bone marrow and in the spleen. Abnormal amounts of iron c
Figura 11: Hierro con azul Prusia de Perls (hígado). Este colorante se utiliza para detectar e identificar el ión férrico (Fe3+) en preparaciones de tejidos, frotis de sangre o frotis de médula ósea. Habitualmente se encuentran cantidades minúsculas de hierro férrico (hemosiderina) en la médula ósea y el bazo. Las cantidades anómalas de hierro pueden indicar hemocromatosis y hemosiderosis.
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Acid Fast Bacillus stains are used to detect and identify acid fast bacilli in tissue. Bacilli are rod-shaped bacterial organisms. A primary function of this stain is to identify tuberculosis in lung tissue, as well as other bacterial bacillus infected ti
Figura 12: Ziehl Neelsen (bacilo acidorresistente, pulmón). Esta tinción se utiliza para detectar e identificar bacilos acidorresistentes en el tejido. Los bacilos son organismos bacterianos con forma de varilla. Una función principal de esta tinción es identificar la tuberculosis en el tejido pulmonar.
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Alcian Blue is normally prepared at an acidic pH of 2.5 and is used to identify acid mucopolysaccharides and acetic mucins. Excessive amounts of non-sulfated acidic mucosubstances are seen in mesotheliomas, certain amounts occur normally in blood vessel w
Figura 13: Azul alcián (intestino). El azul alcián se prepara normalmente en un pH de 2.5 y se emplea para identificar mucopolisacáridos ácidos y mucinas ácidas. Las cantidades excesivas de mucosustancias ácidas no sulfatadas se observan en los mesoteliomas, ciertas cantidades aparecen normalmente en los vasos sanguíneos pero aumentan en lesiones precoces de ateroesclerosis.
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Alcian Blue and PAS combines the properties of both Alcian Blue and Periodic Acid Schiff staining.
Figura 14: Azul alcián y PAS (intestino). Una tinción que combina las propiedades de la tinción con azul alcián y con ácido peryódico de Schiff.
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Gomori Trichrome (blue) (submucosa). Trichrome stains are used to stain and identify muscle fibers, collagen and nuclei. They can be used to contrast skeletal, cardiac or smooth muscle. The Gomori Trichrome is a simplification of the more elaborate Masson trichrome stain and combines the plasma stain (chromotrope 2R) and connective tissue stain to provide a brilliant contrasting picture.
Figura 15: Tricrómico de Gomori (azul) (submucosa). Las tinciones tricrómicas se utilizan para teñir e identificar fibras musculares, colágeno y núcleos. Pueden usarse para el contraste de músculo esquelético, cardíaco o liso. El tricrómico de Gomori es una simplificación de la tinción tricrómica de Masson más elaborada y combina la tinción de plasma (con cromotropo 2R) y tejido conjuntivo para ofrecer una imagen de contraste brillante.
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Gomori Trichrome (green) (submucosa). Trichrome stains are used to stain and identify muscle fibers, collagen and nuclei. They can be used to contrast skeletal ,cardiac or smooth muscle. The Gomori Trichrome is a simplification of the more elaborate Masson stain and combines the plasma stain (chromotrope 2R) with the connective tissue stain to provide a brilliant contrasting picture.
Figura 16: Tricrómico de Gomori (verde) (submucosa). Las tinciones tricrómicas se utilizan para teñir e identificar fibras musculares, colágeno y núcleos. Pueden usarse para el contraste de músculo esquelético, cardíaco o liso. El tricrómico de Gomori es una simplificación de la tinción Masson más elaborada y combina la tinción de plasma (con cromotropo 2R) con la tinción de tejido conjuntivo para ofrecer una imagen de contraste brillante.

Pasos para obtener mejores tinciones especiales

En Leica Biosystems, nuestra visión es avanzar en el diagnóstico del cáncer y mejorar la vida de las personas. Una forma de lograr esta visión es ayudando a mejorar la calidad de la tinción. Puesto que reconocemos que la calidad de la IHC y la ISH no comienza en la estación de tinción, esta serie examina muchos aspectos diferentes de la calidad de la tinción y analiza cómo influirán las pruebas futuras en un mejor diagnóstico.

Comprender la tinción

Sepa qué está intentando demostrar con la tinción que está realizando.

El simple hecho de “seguir el método” y no saber realmente lo que se debe ver en la sección terminada dará lugar a malos resultados.

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Understand the Stain
Sección de hígado teñida con PAS. La lipofuscina y el glucógeno son positivos para PAS, mientras que los restos de bilis y hemosiderina son negativos para PAS y aparecen con sus colores naturales (amarillo y marrón, respectivamente). B. Esta sección muestra una infección micótica oportunista en el pulmón (Aspergillus) teñida con el método de Grocott-Gomori. Las hifas micóticas son negras, al igual que el carbono sin tinción, una característica común en los pulmones de los fumadores y la mayoría de los habitantes de ciudades.

Usar un control positivo

Utilice siempre una preparación de control que contenga la estructura/sustancia que está intentando demostrar.

“Si la estructura/sustancia para la que estamos tiñendo no es visible en una preparación, suponemos que no está presente”.

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Use a Positive Control
A. Sección de hígado cirrótico teñida con el método de Perl para demostrar hemosiderina con hierro (azul). Esto constituiría un bloque de control satisfactorio para las tinciones de hierro.

Usar un tiempo preciso

Use un tiempo preciso.

El tiempo siempre es aproximado. Una temporización imprecisa produce resultados incoherentes.

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Use Accurate Timing
Estas dos secciones de piel del mismo bloque se han teñido con el método PAS. La sección A se trató con ácido peryódico (paso de oxidación) durante 5 minutos, mientras que la sección B solo estuvo 30 segundos (un error). Observe que la membrana basal está muy mal teñida en la sección B como consecuencia.

Considerar la estabilidad de los reactivos

Tenga en cuenta la vida útil de los reactivos que está utilizando. Algunos reactivos o soluciones de tinte se deterioran lentamente, mientras que otros son muy inestables y deben prepararse frescos y utilizarse inmediatamente. Hay que dejar que otros se oxiden (maduren) durante algún tiempo antes de poder usarlos.

Asumimos que todos los reactivos pueden utilizarse durante un periodo indefinido.

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Consider Reagent Stability
Hematoxilina de Weigert turbia debido a la oxidación excesiva. Observe la tinción marrón del colágeno.

Almacenar los reactivos correctamente

Almacenar los reactivos correctamente. Algunos requieren refrigeración porque tienden a soportar el crecimiento de hongos o moho. Otros son sensibles a la luz y requieren un almacenamiento en la oscuridad.

“Todos nuestros reactivos se almacenan en el estante situado encima del banco de tinción. A veces vemos organismos extraviados en nuestras secciones”.

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Store Reagents Correctly
Esta sección muestra grandes depósitos de microorganismos ajenos que han crecido en la solución de tinción (en este caso, hematoxilina) y, a continuación, se han depositado en la parte superior de la sección.

Respetar el método

Siga exactamente el protocolo.

Los miembros del personal obtienen diferentes resultados aunque usen supuestamente el mismo protocolo.

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Adhere to the Method
Estas secciones de submucosa fijada en formol se han teñido con la tinción tricrómica de Masson. La sección A muestra el músculo liso rojo. En este caso, la tinción se realizó correctamente siguiendo el protocolo del laboratorio e incluyendo un paso de ácido crómico preliminar (sensibilización o mordiente secundario). Este paso se pasó por alto cuando se tiñó la sección B. Observe la falta de coloración diferencial del músculo en la sección B (intestino).

Registrar cualquier cambio

Documente cualquier desviación del método que esté utilizando.

A veces, cuando los resultados son malos, es difícil o imposible averiguar por qué no se han registrado los cambios en el protocolo.

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Record Any Changes
En esta tinción de impregnación argéntica para reticulina, las fibras no están bien demostradas y hay espuma de fondo (precipitado) en la preparación. Es muy difícil determinar la causa de dicho problema si el método no se ha seguido exactamente (método de Gordon & Sweets, riñón).

Estandarizar los pasos de lavado

Tenga especial cuidado con los pasos de lavado. Estandarícelos tanto como sea posible, ya que son con frecuencia la causa de resultados variables.

Los miembros del personal del laboratorio utilizan diferentes técnicas de lavado: algunos utilizan una agitación enérgica, otros son mucho más suaves.

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Standardize Washing Steps
Estas secciones de hígado se tiñeron con el mismo método. La única diferencia entre ellas fue la técnica mediante la cual se enjuagaron entre la impregnación y la reducción. Las fibras de reticulina son negras y están mejor definidas en la sección A (método de Gordon & Sweets).

Preparar el microscopio cuidadosamente

Utilice el control microscópico en etapas cruciales, como los pasos de diferenciación. Tenga en cuenta el efecto de la configuración del microscopio sobre el aspecto de las secciones sin cubreobjetos (húmedas); puede producir el aspecto de una tinción de fondo falsa.

Para todos los métodos, el nivel de tinción se evalúa mirando la preparación a simple vista.

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Set Up Microscope Carefully
A: Sección húmeda (sin cubreobjetos) vista bajo un microscopio con diafragma del condensador cerrado. Observe el fondo falso. B: Sección húmeda (sin cubreobjetos) vista bajo un microscopio con diafragma del condensador abierto. Observe el fondo claro.

About the presenters

James Anderson
James Anderson , Global Marketing Manager

James Anderson is a Global Marketing Manager at Leica Biosystems with experience with histology and scientific, technical, and marketing communications.

Geoffrey Rolls
Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.

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