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热诱导抗原表位修复技术简报

在过去 25 年,免疫组织化学 (IHC) 已从一种只有具备强大科研背景的专业实验室才拥有的技术,演变为一种大多数病理学实验室都经常使用的技术。 事实上,IHC 已成为诊断性病理学实验室的一种非常有价值的技术。 IHC 的价值在于这种方法能够识别和定位组织标本中的特异性蛋白(标志物)。 通过确定肿瘤内是否存在特异性标志物,可以为病理学家提供可能有助于准确分类或识别肿瘤的线索。

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介绍

组织固定和处理常常会损害 IHC 的价值或检测能力。 虽然福尔马林固定剂可以很好地保存形态、细胞学和组织结构,但福尔马林固定却大大降低了 IHC 技术的灵敏度。 甲醛可与组织蛋白共价结合,同时也可以与邻近蛋白质或肽交联形成大量蛋白聚集体。 蛋白质和肽与抗原的交联可以阻断或“遮盖”抗原表位,从而阻碍抗体的结合。

用最简单的术语来描述热诱导抗原表位修复 (HIER) 的定义是,通过加热特定缓冲溶液来恢复福尔马林固定石蜡包埋组织中的抗原反应性。 HIER 处理对于诊断过程中所用的 IHC 方式有巨大影响。 而今使用 IHC 对福尔马林固定组织进行常规分析的许多标志物在 15 至 20 年前无法通过这种方式进行评估。

HIER 机制

虽然尚不清楚 HIER 的作用机制,但大多数人认为是通过逆转甲醛介导的抗原化学修饰的某些途径来实现。 有关这一过程的理论很多。 其中最重要的一个理论是,HIER 过程中的热能使周围蛋白质或肽与抗原之间的交联发生断裂。 在这种情况下,通过 HIER 可以“显露”或暴露抗原表位。 另一种理论认为,HIER 通过去除交联部位的结合钙离子发挥作用。 这一理论得到以下事实的支持:多种 HIER 缓冲液(如枸橼酸盐和 EDTA)是钙螯合剂。

加热源

各种加热源(包括微波炉、蔬菜蒸锅、压力锅和水浴槽)均已成功用于 HIER。 加热源所能达到的温度是 HIER 过程中的关键因素。 总体而言,HIER 溶液的温度越高,抗原表位修复效果越好。

蒸锅、水浴槽和微波炉所达到的温度范围介于 94°C 至 100°C 之间。 压力锅能够达到 110-120°C 的温度。通过调整加热时长,可以补偿这些加热源所达到的温度差异。 温度越低,要达到较高温度下所观察到的同等染色强度所需的热暴露时间越长。 因此,适当调整加热时间以补偿最高温度差异,可以使用下列任何加热源来产生相当的染色强度。

虽然可以通过各种加热源来实现 HIER,但每种加热源都有其优缺点(见表)。 微波炉是第一种广泛使用的 HIER 加热源,而今可能是最少使用的加热源。 微波炉内的热量分布通常不均匀或不一致。 加热不均衡会导致染色强度缺乏重现性。 使用微波炉作为加热源的另一个缺点是经常出现强烈沸腾。 沸腾 HIER 溶液产生的搅拌作用可能导致组织与玻片脱离。

与微波炉相反,压力锅、蒸锅和水浴槽可以产生均匀一致的热量分布。 尽管压力锅产生的较高温度对于在短时间内有效修复抗原表位反应性是有利的,但较高温度可能破坏或扭曲组织形态。 使用压力锅时,结缔组织可能被粉碎或烧坏。

表 1: 加热源对比

加热源

优点

缺点  

微波炉  
  • 经济实惠
  • 简单易用
  • 迅速达到所需温度
 
 
  • 热量分布不均匀
  • 强烈沸腾
    • 组织损失
    • 缓冲液蒸发
 
蔬菜蒸锅  
  • 经济实惠
  • 简单易用
  • 热量分布均匀
  • 良好的组织形态
 
 
  • 与微波炉或压力锅相比,需要更长的加热时间 
 
水浴槽  
  • 简单易用
  • 热量分布均匀
  • 良好的组织形态
 
 
  • 昂贵
  • 与微波炉或压力锅相比,需要更长的加热时间 
 
压力锅  
  • 热量分布均匀
  • 高温
    • IHC 的灵敏度更高
    • 所需加热时间较短
 
 
  • 昂贵
  • 由于高温导致伪影和组织损坏 
 

修复缓冲液

自 HIER 开发以来,已广泛采用了各种缓冲液。 目前,根据 pH 和缓冲液成分,HIER 溶液可为三类:

  1. 低 pH (pH ~3-5) 溶液通常使用甘氨酸-盐酸盐缓冲。
  2. 低至中性 pH (pH ~6-7) 溶液使用枸橼酸缓冲。
  3. 高 pH (pH ~8-10) 溶液使用 Tris 或 EDTA 缓冲。

目前的证据表明,HIER 溶液的 pH 值比缓冲液成分更重要。 大多数抗原表位的最佳恢复发生在 pH 值范围为 8-10 的碱性缓冲液中。 EDTA 缓冲液对于过度固定标本以及难以检测到的抗原修复特别有效。 高 pH 和 EDTA 缓冲液并非没有缺点。 高 pH 溶液更容易导致切片从显微镜载玻片上脱落。 此外,EDTA 溶液可能导致形态扭曲以及卷曲和奇形怪状的细胞核。 目前,没有适合所有抗原的“通用”HIER 缓冲液。 每个实验室应评估不同 HIER 溶液对实验室经常评估的各种抗原的修复有效性。 常用的方法是使用枸橼酸盐等缓冲液对大多数抗原进行修复。 高 pH 或 EDTA 溶液可以专门用于通过枸橼酸盐难以修复的抗原。

组织学技术人员的职责

HIER 技术为技术人员或病理学家带来了一系列令人眼花缭乱的加热源和缓冲液。 通过了解抗原修复过程中所用设备和基本试剂的优缺点,可简化这些选择或问题。 应根据实验室规定的性能标准或期望选择加热源和缓冲剂。 技术人员和病理学家应至少了解不同加热源或修复缓冲液对重现性、灵敏度和特异性的潜在影响。 此外,应考虑到加热源和缓冲液的潜在有害作用。

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