냉동 조직 절편

동결은 세포막을 손상시키며 생물학적 시료의 조직학적 가독성을 감소시킵니다. 여기서는 이러한 결과의 원인과 조직학에 사용할 얇은 절편을 박절하기 위해 생물학적 조직을 경화하는 수단으로 동결을 사용할 때 위험을 최소화하거나 방지하는 방법을 설명합니다.

순수는 세 가지 형태의 고체 상태로 존재할 수 있습니다. 두 가지 결정 형태가 있는데 하나는 육각 결정이고 다른 하나는 정육면체 결정입니다. 또한 물은 시간 소모 없이 빠르고 얼어 결정을 형성하고 비정질(유리 같은 형태) 얼음으로 유지될 수 있습니다. 결정은 물이 얼면서 팽창하여(동결 팽창은 물 고유의 특성임) 생성되므로 유리 같은 얼음은 응결 상태에서 팽창하지 않습니다. 이와 같은 특성을 활용하면 생물학적 시료를 사용하기 편리한 형태로 만들 수 있습니다.

동결로 인해 물 성분이 팽창하면 세포막을 확장시켜 세포막에 침투합니다. 동결이 천천히 진행되면 얼음 결정 형성과 팽창 속도가 빨라집니다. 생물학적 시료는 열 전도에 약합니다. 따라서 시료 동결에 온도 구배를 사용하게 되고 일부 얼음 결정은 냉원으로부터 10 mm 이상 떨어진 조직 내부에 형성됩니다. 시료가 차가운 표면에 닿으면 천천히 동결되며, 특히 동결 표면에서 가장 멀리 있는 부위에서 결정이 형성됩니다. 절편을 제작 할 때 천천히 동결되어 큰 결정이 형성된 조직에는 결정 형성의 정도와 크기에 따라 구멍이 여러 개 있고("스위스 치츠" 효과라고 함) 다양한 수준으로 세포 성분이 손실됩니다.

가장 중요한 것은 최종 온도가 아닌 동결 속도입니다. 고속 동결은 냉원과 접촉하는 총 표면 비율, 물 부피, 물(시료)의 시작 온도 및 냉각 방법에 따라 달라집니다. 이상적으로 냉원은 초저온이고 모든 표면에 접촉하도록 배열됩니다

하지만 시료가 신속하게 유리처럼 동결되더라도 이 상태를 유지할 수 없습니다. 유리 같은 얼음은 불안정한 상태입니다. -121˚C 이상에서는 비정질 얼음이 점차 정육면체 얼음으로 다시 구조화되고 팽창합니다. -80˚C 이상에서는 정육면체 얼음이 육각 얼음으로 다시 구조화되고 다시 팽창합니다. 다행히도 온도 구매에 따라 이러한 변환은 천천히 진행되고 물의 순도도 변합니다.

대부분의 일반적인 분야에서는 절편을 제작하려면 조직을 동결 온도 이상으로 데워야 합니다(뇌의 경우 -9~-19˚C이지만 조직 유형에 따라 다름). 그렇지 않으면 조직이 너무 차가워 박절하기 어렵고 나이프 베젤로 구부리면 산산 조각 납니다. 너무 차가운 상태에서 박절하면 "셔터" 또는 나이프 블레이드 방향으로 조각 자국이 남게 됩니다. 조직을 박절할 수 있도록 충분하게 덥힌 후에 바로 절편 제작을 시작해야 합니다. 제상 사이클이 없더라도 조직을 크라이오스탯에 오래 두면 안 됩니다. 이렇게 하면 유리 같은 얼음에서 육각 결정으로 변환되기 시작됩니다. 결정은 얼음을 팽창시키고 세포를 파괴합니다.

초고속으로 동결하려면 대부분의 접촉면을 액체에 담그면 됩니다. 널리 사용되는 두 번째 방법은 조직을 미리 냉각시킨 금속 페데스탈에 놓고 신속하게 드라이 아이스를 조직 주변의 많은 면에 닿도록 분무하는 방법입니다.

액화 질소는 일반적으로 사용할 수 있는 가장 차가운 액체 중 하나입니다. 조직과 섞이지 않습니다. 이러한 특성으로 인해 매질을 동결하는데 이상적입니다. 하지만 액화 질소에는 매우 낮은 비열 상수가 있습니다. 따라서 데워진 조직이 작더라도 접촉점에서 국소적으로 펄펄 끓습니다. 중요한 한 가지는 질소 가스 층인 증기 방벽입니다. 이 증기 방벽을 조직 다음에 만들고 단열하여 냉기를 조직 내에 천천히 침투시킬 수 있습니다. 이로 인해 동결 속도가 예상치 못한 패턴으로 느려집니다. 따라서 조직 외층이 빨리 동결되어 유리처럼 되지만 증기 방벽이 형성되어 냉기가 더욱 느리게 침투하고 조직 내부는 천천히 동결됩니다. 결정이 형성되면 동결된 껍질 내부의 조직이 팽창되어 블록 전체에서 균열이 발생합니다. 블록에서 균일이 발생한 경우 이는 최소한 조직 가장 안쪽에 동결된 결정이 있다는 의미입니다. 이는 큰 조직 블록에서 문제가 되지만(예를 들어 전체 쥐 또는 심지어 생쥐 뇌) 액화 질소는 생검이나 작은 시료를 빠르게 동결시키므로 임상 조직학 실험실에서 성공적으로 사용되고 있습니다.