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Coupes ultrafines du système nerveux central (SNC) : Une meilleure visualisation de la structure neuronale pour l'électrophysiologie et l'imagerie

L. Song, M. Sawchuk, & S. Hochman. Département de Physiologie, Univ. du Manitoba. Winnipeg, MB, Canada R3E 0W3. Adresse électronique : shawn@scrc.umanitoba.ca) Les études électrophysiologiques qui utilisent les enregistrements de patch-clamp dans les coupes de SNC impliquent des stratégies de ciblage "aveugles" ou visuelles. Les enregistrements de neurones identifiés visuellement nécessitent généralement des microscopes droits spécialisés équipés d'optique Nomarski (DIC) ( p.ex. Konnerth et al Pflugers Arch.

414:600, 1989). L'illumination vidéo en infrarouge permet une optimisation additionnelle de l'image (p.ex. Stuart et al Pflugers Arch. 423:511, 1993). Ces approches efficaces nécessitent néanmoins un équipement spécialisé et coûteux. Image : Un test de viabilité cellulaire (vert : cellules vivantes ; rouge : cellules mortes) montre l'abondance de cellules vivantes sur la tranche d'un rat P8 (barre d'échelle = 100µm)

La capacité de résolution des détails des éléments cellulaires étant généralement limitée à 40-50 mm de la surface de la tranche, nous avons développé une stratégie alternative pour visualiser les neurones en utilisant une préparation ultramince (20-50 mm) semi-transparente, visualisée à l'aide d'un microscope inversé équipé d'une optique de modulation de contraste d'Hoffman.

Des cervelets, des hippocampes et de la moelle épinière isolés à partir de rats nouveaux-nés (P1 - P14) ont été enrobés dans l'AGAR (2.5% w/v) et coupés avec un microtome à lame vibrante Leica VT1000E. Après incubation à 32°C, les tranches ont été fixées au plancher de la chambre d'enregistrement et maintenues à température ambiante.

La transparence accrue dûe à l'épaisseur réduite de la tranche a permis une résolution optique supérieure des arborisations dendritiques et axonales et les cellules étaient visibles sur toute l'épaisseur de la tranche. Image : Les résultats révèlent une abondance de cellules vivantes sur toute la tranche (rat P1) (barre d'échelle = 50 µm)

Le marquage des cellules vivantes et mortes a révélé que beaucoup de cellules restent viables pour l'imagerie et l'expérimentation électrophysiologique.

Dans toutes les régions du SNC examinées, les neurones étaient facilement identifiables pour les enregistrements de patch-clamp.

Bien que ceci n'ait pas encore été testé, un microscope inversé devrait permettre l'utilisation d'objectifs à immersion à grande ouverture numérique pour des expériences simultanées d'imagerie et l'épaisseur réduite de la tranche devrait accélérer l'équilibration et le temps d'élimination des molécules actives. Supporté par le Réseau NeuroScience Canadien.

Image : Immunomarquage de cellules gliales CAA1 avec la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) (barre d'échelle = 50 µm) (pour les procédures de culture, voir Parsley, C.P. et al. Society for Neurosci. Abstr. 230.5, 1996)