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Cortes ultrafinos del SNC: Mejor visualización de la estructura neuronal para electrofisiología y estudios de imágenes

L. Song, M. Sawchuk, & S. Hochman. Departamento de Fisiología, Universidad de Manitoba. Winnipeg, MB, Canadá R3E 0W3. Dirección de correo electrónico: shawn@scrc.umanitoba.ca) Los estudios electrofisiológicos que usan los registros obtenidos con la técnica "patch clamp" en preparaciones de cortes del SNC implican estrategias de blancos "ciegos" o visuales. Los registros de neuronas identificadas visualmente generalmente requieren microscopios verticales especializados equipados con óptica Nomarski (DIC) (por ejemplo, Konnerth y col. Pflugers Arch.

414:600, 1989). Para optimizar más las imágenes a fin de observar los procesos neuronales se utiliza iluminación de longitud de onda infrarroja mejorada con vídeo (por ejemplo, Stuart y col. Pflugers Arch. 423:511, 1993). Aunque potentes, estos métodos requieren equipo costoso especializado. Imagen: Ensayo con células vivas (verdes) y muertas (rojas) que muestra abundantes células vivas en todo el corte de una rata P8 (barra de escala = 100 µm)

Puesto que la capacidad para resolver características celulares detalladas se limita, en general, a 40-50 mm de la superficie del corte, hemos desarrollado una estrategia alternativa para visualizar las neuronas utilizando una preparación de corte "ultrafino" semitransparente (20-50 mm) visualizado en un microscopio invertido equipado con óptica de modulación Hoffman.

El cerebelo, el hipocampo y la médula espinal aislados de ratas neonatas (P1- P14) se incrustó en AGAR (2,5% p/v) y después se seccionó con un microtomo de cuchilla vibratoria Leica VT1000E. Después de la incubación a 32°C, los cortes se fijaron a la parte inferior de la cámara de registro y se mantuvieron a temperatura ambiente.

La mayor transparencia debido a un grosor menor del corte permitió una resolución óptica superior de los procesos dendríticos y axonales y las células fueron visibles en todo el grosor del corte. Imagen: El indicador de células vivas revela la abundancia de células vivas en todo el corte (rata P1) (barra de escala = 50 µm)

. La tinción de células vivas/muertas reveló que muchas células seguían siendo viables para estudios de imágenes y experimentación electrofisiológica. En todas las regiones estudiadas del SNC, las neuronas se identificaron fácilmente para registros satisfactorios de parches.

Aunque no se ha probado todavía, el uso de un microscopio invertido debe permitir el uso de objetivos de inmersión en aceite de apertura numérica alta para experimentos simultáneos de imágenes y el menor grosor del corte adelantaría del equilibrio farmacológico y los tiempos de reposo farmacológico. Respaldado por la Red Canadiense de Neurociencias.

Imagen: La inmunotinción de células gliales CAA1 con GFAP (barra de escala = 50 µm) (para procedimientos de cultivos de cortes, véase Parsley, C.P. y col. Society for Neurosci. Abstracto. 230.5, 1996)