切片、展片和干片

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从患者到病理学家,准备样本进行诊断需要细心、经验以及合理的流程。本指南提供了很多有建设性的建议,更简单的方法去避免常规错误。

本周指南中提供了做好样本收集和转运的小贴士,我们想提供更多有建设性的建议,更简单的方法去避免常见错误。

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步骤31 - 使用高质量的刀片

 使用高质量、锋利的刀片进行切片;

 刀片用到不能再用——可以接受少量刀痕。

A. 脾脏H&E染色结果:图中可以看到很多有因刀片缺陷而产生的刀痕;
使用高质量的刀片
B. 皮肤组织切片进行展片,可以看到组织上有多条很明显的刀痕,展片的时候刀痕很容易看到。
使用高质量的刀片

步骤32 - 优化刀片倾斜的角度

 根据切片机以及刀片类型进行一定的倾斜,确保最合适的切片角度

 刀片倾斜角度不因实际情况(不同的切片机、刀片和石蜡等)进行改变

这个短的蜡带是从冰蜡块上切下的有30%~40%皱起。重新调整刀片的角度后这一情况得到改善。
优化刀片倾斜的角度

步骤33 - 小心修块

 蜡块需要进行修蜡,以暴露组织。修蜡的最后几刀,是为了使蜡块表面光滑;

 为了节省时间,匆匆修蜡。蜡块表面不光滑就进行切片,切面就像“虫咬”过一样,到处都是小的、零乱的空洞。

蜡块表面不光滑就进行切片,导致切片有空洞(筛网状)及破碎不齐的现象(H&E)
小心修块

步骤34 - 避免冰冻对组织的破坏

 蜡块在冷台上冷却,并且保证切片时是冷的(表面融冰正好);

 蜡块在切之前已经冷冻,这很容易引起蜡块冻裂。

由于在切片之前蜡块已经放到-15℃冰柜中进行冷冻,蜡块表面有裂痕。裂痕会对切片和展片有影响,因为蜡和组织连接不紧密。
避免冰冻对组织的破坏

步骤35 - 蜡块需冷却

 需保证切片时蜡块是冷的;

 切片过程中在采集需要的蜡片时,蜡块已变热

A. 肾切片中肾小球变形(H&E)是因为在切片过程中过度挤压;
B. 图中切片来自同一个蜡块,左边切片没有进行冷却,而右边的蜡块是冷却后再切。
蜡块需冷却

步骤36 - 缓慢切片

 每一个蜡块最终需要的切片需进行匀速、缓慢地切片;

 认为“所有切片皱褶的在展片过程中都能消除”,所以有的技术员在切片中常进行快速的切片。

A. 啮齿类动物肝脏(网状纤维染色)有规则的颤痕,原因在于对冷却的易脆组织切片太快。为避免这种情况产生,可以待蜡块稍微变暖然后慢慢切片。如果蜡块或者刀片没有在切片机上很好地固定也有可能导致这种颤痕;
B. 图中粘膜组织的H&E切片显示有规则的颤痕,原因在于对冰冻的蜡块切片速度太快。
缓慢切片

步骤37 - 使用干净的水

 定期更换漂片仪中的水;

 漂片仪中的水量够,但是并不是定期更换。水中的任何污染都有可能随着切片到玻片上(真菌、霉菌等)。

胃肠道浆膜面(H&E):微生物簇的染色虽然很弱,但任然能在组织、玻片以及组织外看到。这些污染物的来源很可能就是展片引起的。
使用干净的水

步骤38 - 确保玻片干净

 使用玻片之前一定检查是否干净。正确的拿取玻片,可以避免在展片前鳞状细胞的污染;

 不检查玻片是否干净:“只要切片能够在染色过程中粘附在玻片上即可”。灰尘、微生物和其他污染物都会导致得不到一张好的切片。

A. 肾脏切片被玻片上已有的黑色污染物污染了,在玻片其他地方也能看到污染物;
B. 肺染色切片含有染上色的模糊部分,这有可能是组织干掉形成的。粘合剂(可能是明胶)在水浴中漂浮,粘合剂中的蛋白成分随着水蒸气的蒸发会更加集中。干燥前适当排水能够解决这个问题。
确保玻片干净

步骤39 - 避免交叉污染

 为了避免样本之间的交叉污染,在进行下张切片展片时需去除水面之前标本的残渣;

 每一个蜡块之间未对水面进行清洁。这可能导致不同样本之间的交叉污染,这可能引起混乱,甚至误诊。

心脏肌肉被甲状腺碎片污染。原因可能是不同样本在展片过程污染引起的。
避免交叉污染

步骤40 - 避免鳞屑污染

 注意漂片过程中不要摸头发或者手(鳞屑可能污染切片);

 “我们一些员工制出来的片子含有很多鳞屑,他们可能不知道这个是可以避免的”。

肾切片上部含有很多外来的鳞屑,这可能是展片过程中沉积的。它们牢牢地粘附在玻片上,随后被染上了伊红。
避免鳞屑污染

步骤41 - 避免不同蜡块的切片同时展片

 来自不同蜡块的切片从来不同时展片;

 有时候来自两个或更多蜡块的切片同时展片片。这是非常危险的事情,有可能会导致样本识别错误,尤其是在切取同一类型的标本时。

来自两块不同蜡块的切片同时展片,这可能导致混乱或者样本识别错误。
避免不同蜡块的切片同时展片

步骤42 - 检查水温

 漂片仪的温度实时监控,确保漂片仪中的温度低于蜡的熔点4-5℃。切片必需展平,但是蜡不能熔解;

 切片在漂片仪上放置超过15s,蜡就会熔解。虽然这样看起来可以使整个流程加快,但有可能引起组织过度扩张和细胞受损。

这些皮肤切片上有明显的裂缝和大量的分离层,典型的过度扩张引起的。处理不当的组织很容易有这个问题。
检查水温

步骤43 - 避免皱褶

 切片在漂片仪上平展地放置;

 切片在漂片仪上放置不平,漂片仪温度过低的话,会导致切片在捞片的时候有皱纹。

图中,展片不能消除切片过程产生的褶皱。更好的切片技术和稍微热一点的水能够帮助解决这个问题。
避免皱褶

步骤44 - 避免切片过度扩张

 切片在漂片仪中展平后,马上捞起;

 为了方便,在漂片仪中的展片时间过长,有可能引起组织因过度扩张和细胞受损(特别是对一些小的易碎组织,如淋巴组织)。

A. 使用PAS染色做的肠道粘膜切片:固有膜层过膨胀(显示肠腺的过度分离),主要是因长时间在过热的漂片仪中展片。
B. 因在漂片仪中过度扩张,淋巴组织有裂痕。淋巴和造血组织特别容易受损。
避免切片过度扩张

步骤45 - 不要损坏漂浮的组织

 用钳子和刷子去除皱褶的时候,特别小心,避免损坏组织;

 在用钳子或者刷子去除褶皱的时候,用力过度,这种过程很容易或多或少对组织产品影响。

心脏肌肉有机械损伤(孔),这是在试图移动叠在一起的切片时引起的(心脏,H&E)。
不要损坏漂浮的组织

步骤46 - 仔细选择切片

 不捞取蜡带上第一或者第二张切片;

 每条蜡带上第一或者第二张切片看起来比后续的切片更好,这是因为他们比较厚,引起这样的原因是因为刀片在刚切冷的蜡块时刀片的摩擦导致蜡块热胀冷缩引起的。

蜡带上每一张切片按照顺序编号,图中可以看到前两张切片最宽(最少挤压),但是随着蜡块温度上升减弱,切片变窄(更多挤压)。虽然切片机设置为3μm,第一、二张切片由于热胀原因可能有4-5μm。
仔细选择切片

步骤47 - 避免切片下有气泡

 仔细操作,避免漂片仪中有气泡产生。放置切片进行展片前,消除一切可见的气泡;

 忽视漂片仪中的小气泡。切片中的气泡会在干片过程中消失,但是有气泡的地方经常会变形,并且很可能会在染色过程中掉片。

肝脏H&E染色切片:有一个圆形的、破损的区域,这个区域的切片看似鼓起来了。原因是切片在展片过程中混入了气泡,从而阻碍了切片平整牢固地粘附在玻片上。
避免切片下有气泡

步骤48 - 避免切片翘起

 适当使用带电荷或者含有粘附剂的载玻片,避免切片翘起;

 切片可能在染色过程中脱落(特别是经历过IHC抗原修复,或者其他需要加热的方法)。这种情况下使用带电荷或者其他粘附玻片是非常重要的。

肺H&E染色切片:切片翘起,覆盖在旁边的组织上。
避免切片翘起

步骤49 - 干燥前控干

 组织放在烤片机或烤盘前自然干燥

 在未完全干燥前,玻片水平放置,组织可能会在水平位置移动,或干燥后组织不在同一平面上。

这是因为组织在烤片前没有有效的干燥。其结果是,在该领域的中心可见一个凸起的焦点外区域。
该组织刚从摊片机中捞出,在放到烤片机前,需要在垂直方向上放置一段时间自然干燥,可以避免A图所示情况出现。
干燥前控干

步骤50 - 监测干燥温度

 对干燥器的温度进行仔细监测。

 有时干燥器很热。热量过多会导致局部过热,造成不均匀染色。

该图片显示了前列腺组织的“核溶解”,其中一个可能的原因,即在干燥处理时温度过热。错误的脱水过程也可以产生类似的效果。核溶解现象通常出现在标本的周边,通常会影响到上皮组织。
细胞核呈现不均匀的染色,可能染色呈粉红色或蓝色,完全缺乏细节。
监测干燥温度

步骤51 - 适当的干燥时间

 注意监测最小和最大玻片需要干燥的时间

 不同玻片需要干燥的时间相差很大。在较高的温度下延长干燥时间可能会对玻片造成损害。

由于在太高的温度下延长干燥,淋巴结HE染色切片,呈现广泛的开裂。同样,像这样的裂缝也可能是由其他因素造成的,比如过度脱水。
适当的干燥时间

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