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标本制备简介

在显微镜下检查人体细胞和组织的理由有很多。医学和生物研究的基础在于:了解细胞和组织的正常结构和功能以及它们所组成的器官和结构。在正常健康状态下,细胞和其他组织组分以常规可识别模式排列。各种化学和物理影响所引起的变化通过显微镜下的结构改变反映出来,许多疾病表现为与正常状态不同的典型结构和化学异常。识别这些变化并将其与特定疾病联系起来,是组织病理学和细胞病理学的基础,也是现代医学的重要专业化过程。显微镜在血液学(血液研究)、微生物学(包括寄生虫和病毒在内的微生物研究)中起到重要作用,在生物学、动物学和植物学领域中则更广泛。在所有这些学科中,均在显微镜下检查标本。

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显微镜

显微镜检查有许多不同的形式,但最常用的是“明场”显微镜,其中用一束可穿透标本的光照射标本(与电子显微镜中的电子束相反)。要使用明场显微镜成功检查标本,一般要求是

  • 标本中的细胞和其他组分保存在一个“像活着的”状态下(这个过程称为“固定”)
  • 标本是透明而非不透明的,以便光可以穿透标本
  • 标本薄而扁平,仅存在单层细胞
  • 有些组分着色(染色)不同,以便将其清楚区分。

制备选项

由于显微镜要求,制备标本的选项限于:

  • 整体封装,其中整个微生物或结构足够小或足够薄,可直接放在显微镜玻片上(例如,较小的单细胞或多细胞微生物或可在玻片摊薄的薄膜)
  • “挤压”制备,故意将细胞压扁或压碎在玻片上以显示其内容(例如,破坏细胞来显示染色体的植物标本)
  • 涂片,其中标本由悬浮于液体(例如血液、精液、脑脊液或微生物培养液)中的细胞组成,或者从表面或器官内部刮取或抽吸(抽出)单个细胞(脱落细胞学)。涂片是众所周知的“巴氏涂片检测”的基础,该检测用于筛查女性宫颈癌。
  • 切片,以某种方式支撑标本,以便从中切出非常薄的切片,将切片封装在玻片上并进行染色。使用一种称为“切片机”的仪器制备切片。

在这些选项中,只有整体封装和切片可保持单个细胞与细胞外组分之间的结构关系。涂片和挤压制备可提供关于单个细胞和相对细胞数量的详细信息,但会缺失结构关系。在这些方法中,切片制备在技术方面是最复杂的,因为它需要专业设备和大量专业知识。由病理学家对切片进行显微镜检查是癌症诊断的基石。尽管使用动物和植物材料制备切片的方法是相似的,但以下描述与动物(人)组织相关。

切片制备

大多数新鲜组织非常脆弱,容易变形受损,因此无法用来制备薄切片(薄片),除非它在切割时有某些方式可以提供支持。在制备切片之前,通常还需要保存或“固定”标本。概括地讲,可以采用两种策略来提供这种支持。

1. 组织可以速冻,并在使用恒冷箱切片机(冷冻室中的切片机)进行切片时保持冷冻状态。 这些称为“冷冻切片”。冷冻切片可以非常快速地制备,因此当需要术中诊断来引导外科手术或需避免对细胞化学组成有任何类型的干扰时(如一些组织化学检查),可使用这些切片。

2. 或者,可以使用一种液体制剂来浸润标本,这种液体制剂随后可转化成一种具有相应物理特性的固体,从而可以将标本切割成薄切片。可以使用不同的制剂进行标本浸润和支撑,包括环氧树脂和甲基丙烯酸酯树脂,但石蜡基组织学专用蜡最常用于常规光学显微镜。这样就会切成所谓的“石蜡切片”。这些切片通常用“旋转式”切片机制备。“旋转式”描述该仪器的切割操作。在所有组织病理学实验室中,通常使用几乎所有标本制备石蜡切片,并将其用于诊断。

以下段落描述了制备石蜡切片的主要步骤。这些步骤通常决定了大型专科组织病理学实验室的布局和工作流程,而在这些实验室中,每天都会处理数百份标本。

图 1:使用恒冷箱切片机制备诊断切片。将用速冻组织切成的切片挑到一个温热的玻片上,立即在玻片上固定切片,并进行染色。
图 2:用于切割石蜡切片的旋转式切片机。将前景中,一段切片正“漂浮”准备好封装在显微镜玻片上。

标本接收

接收用于组织学检查的标本可能有许多不同的来源。其范围可从极大的标本或整个器官到微小的组织碎片。例如,以下是组织病理学实验室中常接收到的一些标本类型。

  • 切除标本(手术活检),在手术时切除整个器官或受累部位
  • 切口活检标本,从受累部位内取下组织进行诊断
  • 钻孔活检,通过钻孔取出一小块可疑组织进行检查(通常来自皮肤)
  • 刮拭活检,从表面(通常是皮肤)上“刮取”较小的组织碎片
  • 刮宫,从子宫或宫颈的黏膜上刮取小片组织
  • 空芯针穿刺活检,有时使用一根特殊的针穿过皮肤(经皮)取出少量组织样本。

标本通常按照存放在固定剂(防腐剂)中的方式来接收,但有时到达时还是新鲜状态,必须立即固定。在实验室接受标本之前,将仔细检查识别信息(标签内容)和随附文件,所有详细信息均有记录,并开始“标本追踪”。对患者或研究标本进行适当识别并尽量减少不准确性的风险至关重要。

图 3:手术切除后的新鲜未固定标本。为了防止变性或干燥,应尽快固定标本。

固定

固定固定是制备标本来进行显微镜检查的一个关键步骤。其目的是防止腐烂,并将细胞和组织保存在一个“像活着”的状态下。阻止酶活性、杀灭微生物并使标本变硬,同时保持充分的分子结构以便可使用适当染色方法(包括涉及抗原-抗体反应的方法和取决于 DNA 和 RNA 保存的方法),即可实现这种目的。从血液供应中分离标本后,越早开始固定,结果越好。最常见的固定剂为甲醛,通常为磷酸盐缓冲溶液(通常称为“福尔马林”)形式。理想情况下,在处理标本之前,应将样本浸入福尔马林 6-12 小时进行固定。

图 4:固定在福尔马林中的手术标本,准备好进行巨检。请注意,与标本大小相比,固定剂的量很大。在处理过程中已在装有标本的包埋盒上打印了患者识别信息。

取材

取材(通常称为“切检”)涉及对标本进行仔细检查和描述,包括外观、标本块数量及其尺寸。较大的标本可能需要进一步切开,以从适当部位切下代表性片块。例如,可以从肿瘤切缘处取多个样本,以确保已完全切除肿瘤。对于较小的标本,可以处理整个标本。选择用于处理的组织将放在包埋盒(小孔篮)中,成批上样到组织处理机上处理,直至浸蜡。

图 5:以上手术胃标本固定在福尔马林中。现在将从适当部位取约 4 mm 厚的切片,放入贴标的包埋盒中进行处理。

处理

处理大批量标本以进行石蜡切片制备时,使用称为“组织处理机”的自动化仪器。这些仪器可以在熔化石蜡加工的一系列不同的溶剂中浸润标本。标本一开始处于水环境中(水基),且必须通过溶剂(通常为乙醇和二甲苯)脱水和清除的多次变化后才能放入熔化的蜡(疏水且不混溶于水)中。对特定批次标本选择的“处理时间表”的持续时间和步骤详细信息取决于标本的性质和大小。对于较小的标本,时间表可短至 1 小时,对于较大的标本,时间表可长达 12 小时或更长。在许多实验室中,大批量处理需过夜。目前,在使用可快速处理的处理机来改善工作流程并缩短周转时间方面,实验室面临的压力很大。

图 6:一台载有一篮装有待处理组织标本的包埋盒的组织处理机。处理机屏幕上显示了有关处理步骤和时间表的详细信息。
图 6:一台载有一篮装有待处理组织标本的包埋盒的组织处理机。处理机屏幕上显示了有关处理步骤和时间表的详细信息。

包埋

处理后,将标本放在包埋中心,在包埋中心将标本从包埋盒中取出并放入蜡填充的模具中。在这个阶段,应仔细定向标本,因为这将决定切割切片的平面,最终可能决定是否可在显微镜下观察到异常部位。在组织已处理的包埋盒中带有标本识别详细信息,现在将包埋盒放在模具顶部,并添加更多蜡来将其黏附固定。现在,标本“块”可在一个冷表面上固化,固定后即可移除模具。包埋盒现在充满了蜡并形成了组织块的一部分,为夹入切片机提供了稳定的底座。含有标本的块现在已准备好进行切片切割了

图 7:包埋中心可以通过整合冷板、热板和熔化蜡的受控流来帮助操作员。
图 8:将胃标本放在包埋中心热板上的一个包埋模具中并对其进行定向。
图 9:准备好标本块进行切片。胃标本已经处理和包埋,可使用切片机进行切片制备。在处理过程中使用浅蓝色包埋盒装入标本,现在形成“块”的一部分。将其牢固夹在切片机的标本架中,从块表面切下切片。
 

切片

在使用极精细的钢刀片的称为“切片机”的精密仪器上切割切片。通常按 3-5 µm 厚度切割石蜡切片,确保切片仅包含一层细胞(红细胞直径约为 7 µm)。将石蜡作为包埋剂的优势之一是,在切割切片时,切片会在边缘处粘在一起,形成一条切片“带”。这使得处理更容易。

现在,在漂浮浴中切片会“漂浮”在温水表面,切片会变平整,然后将切片挑取到显微镜玻片上。彻底干燥后,准备好进行染色。

图 10:使用旋转式切片机从石蜡块上切下切片带。请注意,4 µm 厚(4/1000 毫米)切片只有很小的变形或破坏。
图 11:在石蜡切片于温水中漂浮变平整后,将其封装到显微镜玻片上。

染色

除了一些天然色素(如黑色素)外,细胞以及构成大多数标本的其他组分是无色的。为使用明场显微镜显示结构详细信息,需要某些形式的染料。在提供基本结构信息时,普遍作为起始点的常规染料是苏木精和曙红 (H&E) 染料。通过这种方法,细胞核被染为蓝色,而细胞浆和许多胞外组分被染为粉红色。在组织病理学中,仅需检查 H&E 即可诊断许多疾病。但有时需要额外的信息来提供完整的鉴别诊断,而这需要更多更专业的染色技术。这些可能是使用染料或金属浸渍来定义特殊结构或微生物的“特殊染剂”,或是涉及使用标记抗体来定位对诊断有用的蛋白的免疫组织化学方法 (IHC)。可能还需要原位杂交 (ISH) 等分子方法来检测特定 DNA 或 RNA 序列。这些方法均可用于石蜡切片,在大多数情况下,所产生的玻片完全稳定,可保存很多年。

染色后,切片用玻璃盖玻片盖住,然后送给病理学家,他们将在显微镜下观察后作出适当诊断并形成报告

图 12:H&E 染色。这是一张使用明场显微镜拍摄的人阑尾壁石蜡切片的显微图像(显微像)。细胞核被染为蓝色,而平滑肌、胶原和其他组分则被染为粉红色。较大的透明空间是脂肪细胞的,因为在处理过程中脂肪已被溶解。
图 13:一板石蜡切片正被上样到自动染色仪上进行 H&E 染色。此仪器将对切片进行染色,相邻的自动玻璃盖玻片封片机会将玻璃盖玻片盖在切片表面,以保存切片并提供最佳的显微镜光学条件。

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